丹参SmCPS1和SmCYP76AH1双基因超表达转基因株系的获得及光合特性分析

作     者：郭广洋 李义龙 胥华伟 王婷 侯典云 吕淑芳 GUO Guang-Yang;LI Yi-Long;XU Hua-Wei;WANG Ting;HOU Dian-Yun;LYU Shu-Fang

作者机构：河南科技大学农学院 

出 版 物：《农业生物技术学报》 (Journal of Agricultural Biotechnology)

年 卷 期：2024年第32卷第9期

页      面：2033-2048页

核心收录：

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：河南省自然科学基金(222300420149) 河南科技大学博士科研启动基金(2022YFD1200400) 河南省中药材产业技术体系(2023-24) 河南省中药产业自然科技专员服务小组(21010486) 

主　　题：丹参酮 多基因垛叠表达系统 柯巴基焦磷酸合成酶基因(SmCPS1) 细胞色素P450单加氧酶基因(SmCYP76AH1) 亚细胞定位 光合特性 

摘      要：丹参（Salvia miltiorrhiza）为中国传统中草药，其活性成分主要包含丹参酮类和丹酚酸类化合物。为了探索丹参酮合成途径中多个关键基因共同超表达后对丹参生长和活性物质积累的影响，本研究对丹参酮合成途径下游关键基因柯巴基焦磷酸合成酶基因1 （cobacyl pyrophosphate synthetase gene 1,SmCPS1）和细胞色素P450单加氧酶基因1 （cytochrome P450 monooxygenase gene 1,SmCYP76AH1）的组织表达及所编码蛋白的亚细胞定位进行了分析，并利用多基因垛叠表达系统构建了SmCPS1和SmCYP76AH1同时超表达的载体pYLTAC380H-SmCPS1-SmCYP76AH1，通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的方法一次性转化丹参无菌苗，经过愈伤组织诱导培养、抗性和绿色荧光信号筛选、基因组整合鉴定及转化后基因转录水平的检测，获得了双基因共同超表达丹参株系。进一步对SmCPS1和SmCYP76AH1双基因超表达株系的丹参酮含量及光合和荧光特性进行了测定。结果显示，组织表达水平上，SmCPS1和SmCYP76AH1在丹参的根、茎和叶片中都有表达，二者都在丹参根中高表达；共聚焦显微镜扫描显示，SmCPS1定位于细胞质和叶绿体，SmCYP76AH1定位于内质网。SmCPS1和SmCYP76AH1双基因超表达株系根中的丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA和隐丹参酮的含量都极显著提高（P≤0.01），叶片蒸腾速率（transpiratiom rate）和气孔导度（stomatal conductance）都明显下降，胞间CO2浓度（intercellular CO2concentration,Ci）和净光合速率（net photosynthetic rate,Pn）随双基因的表达水平呈现不同的变化；双基因超表达株系的初始荧光（initial fluorescence,F0）、最大荧光（maximum fluorescence,Fm）和非光化学猝灭系数（non-photochemical quenching coefficient,NPQ）都明显升高，但光合系统Ⅱ（photosystemⅡ,PSⅡ）的最大光化学效率（maximum photochemical efficiency,Fv/Fm）不变。本研究建立的多基因转化方法和获得的双基因超表达株系为进一步研究丹参酮的调控提供了实验材料和方法，为SmCPS1和SmCYP76AH1在丹参地上部分的功能挖掘提供了参考。