Rab5对禽偏肺病毒C型复制影响的研究

作     者：冯旭飞 亓宇翔 于瀚哲 张正洲 王如嘉 孟闯 董魁 FENG Xu-fei;QI Yu-xiang;YU Han-zhe;ZHANG Zheng-zhou;WANG Ru-jia;MENG Chuang;DONG Kui

作者机构：山西医科大学公共卫生学院山西太原030001 山西医科大学煤炭环境致病与防控教育部重点实验室山西太原030001 扬州大学兽医学院(比较医学研究院)江苏扬州225009 扬州大学江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009 扬州大学江苏省人兽共患病重点实验室江苏扬州225009 

出 版 物：《中国预防兽医学报》 (Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine)

年 卷 期：2024年第46卷第5期

页      面：447-454页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：江苏省高等学校基础科研(自然科学)面上项目(21KJB230009) 江苏省人兽共患病学重点实验室开放课题(R2106) 

主　　题：脑内Ras类似物5 禽偏肺病毒C型 复制 表达水平 互作 

摘      要：为探究禽偏肺病毒C型(aMPV/C)感染A549细胞后,脑内Ras类似物5(Rab5)对病毒复制的影响,本研究将重组质粒p GFP-Rab5和负显性突变的Rab5(pGFP-Rab5-DN)分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的a MPV/C感染该细胞,48 h后进行激光共聚焦显微镜观察,结果显示Rab5、Rab5-DN和aMPV/C N蛋白均分布于细胞质中,且Rab5与aMPV/C N蛋白存在明显的共定位。进一步采用Image J软件对细胞内的荧光强度分析后发现,Rab5与aMPV/C N蛋白存在多处共定位,而Rab5-DN与aMPV/C N蛋白无明显共定位,表明Rab5参与aMPV/C的复制。将p CMV-Flag-Rab5和p CMV-Flag分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后分别收集上清和细胞样品。分别采用western blot检测Rab5及aMPV/C N蛋白的表达水平、荧光定量PCR(qPCR)检测a MPV/C N基因转录水平、TCID_(50)检测细胞上清的病毒效价。结果显示,与转染p CMV-Flag的细胞相比,转染p CMV-Flag-Rab5的细胞中Rab5的表达水平明显升高;此外,p CMV-Flag-Rab5转染组中的aMPV/C N蛋白表达水平和N基因的转录水平均极显著升高(P0.01),病毒效价显著升高(P0.05)。表明,过表达Rab5促进aMPV/C的复制。将siRab5和siNC分别转染A549细胞,24 h后分别以MOI 1的aMPV/C感染该细胞,48 h后分别收集上清和细胞样品。分别采用western blot检测Rab5及aMPV/C N蛋白的表达水平、q PCR检测aMPV/C N基因的转录水平、TCID_(50)检测细胞上清的病毒效价。结果显示,与转染si NC的细胞相比,转染siRab5的细胞中Rab5的表达水平明显降低;同时,siRab5转染组中aMPV/C N蛋白的表达水平和N基因的转录水平均极显著降低(P0.01),病毒效价显著降低(P0.05)。表明,干扰Rab5表达可抑制aMPV/C的复制。将p CMV-mcherry-Rab5与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白的重组质粒分别转染A549细胞,24 h后采用激光共聚焦显微镜观察发现Rab5蛋白与aMPV/C N、F、M、G、SH、P、M2-1、M2-2、L1、L2、L3蛋白均在细胞质中存在荧光信号重叠,但该蛋白与L4蛋白无该现象,表明Rab5蛋白可与多个aMPV/C蛋白共定位。将p CMV-Flag-Rab5分别与表达融合GFP的aMPV/C结构蛋白的重组质粒共转染HEK293T细胞,48 h后采用Co-IP试验检测Rab5与不同aMPV/C结构蛋白的相互作用。结果显示,IP样品中表达G和L2蛋白的位置出现了特异性条带,而其他蛋白无条带,表明Rab5与aMPV/C G和L2蛋白存在互作。上述结果首次证实,Rab5通过与aMPV/C多个蛋白(G和L2)的互作参与aMPV/C的复制机制。本研究为阐明Rab5调控aMPV/C复制的分子机理提供研究借鉴。