DF-1细胞ANP32A基因缺失株的基因编辑及其对AIV复制的抑制效应

作     者：魏天悦 于萌萌 王震 谢雨杭 王晓钧 夏长友 孟庆文 

作者机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室 

出 版 物：《中国兽医科学》 (Chinese Veterinary Science)

年 卷 期：2024年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：国家重点研发计划(2022YFF0710501、2022YFF0711005) 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610302022018) 

主　　题：CRISPR/Cas9 chANP32A 腺病毒 H9N2禽流感病毒 抑制 

摘      要：禽流感病毒（AIV）能劫持宿主ANP32A蛋白与流感病毒聚合酶结合，促进AIV复制，但chANP32A调节流感病毒复制的分子机制尚存在诸多未知。本研究利用腺病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术，靶向chANP32A 129位氨基酸（AA）设计、合成了sgRNA序列，构建Ad-SpCas9腺病毒载体、包装腺病毒。以重组腺病毒感染的DF-1细胞经亚克隆培养、PCR扩增和基因组测序，鉴定到3株缺失6、21、24个碱基的细胞株。以H9N2禽流感病毒感染细胞，RT-qPCR结果显示，KO-6、KO-21、KO-24细胞株的病毒基因组RNA拷贝数显著降低；TCID50测定病毒生长曲线，病毒滴度显著下降；流感病毒双荧光素酶报告系统测定聚合酶活性，结果显示缺失细胞株流感病毒聚合酶活性降低30～3 000倍。研究发现，KO-6、KO-21细胞株抑制AIV复制，KO-24细胞株显著抑制AIV复制，缺失chANP32A 125～132 AA更显著抑制AIV复制。本研究为chANP32A基因功能研究以及研发具有抗禽流感病毒且chANP32A生物学功能不改变的基因编辑鸡奠定了基础。