DF-1细胞ANP32A基因缺失株的基因编辑及其对AIV复制的抑制效应
作者机构:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室
出 版 物:《中国兽医科学》 (Chinese Veterinary Science)
年 卷 期:2024年
学科分类:090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学]
基 金:国家重点研发计划(2022YFF0710501、2022YFF0711005) 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610302022018)
主 题:CRISPR/Cas9 chANP32A 腺病毒 H9N2禽流感病毒 抑制
摘 要:禽流感病毒(AIV)能劫持宿主ANP32A蛋白与流感病毒聚合酶结合,促进AIV复制,但chANP32A调节流感病毒复制的分子机制尚存在诸多未知。本研究利用腺病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,靶向chANP32A 129位氨基酸(AA)设计、合成了sgRNA序列,构建Ad-SpCas9腺病毒载体、包装腺病毒。以重组腺病毒感染的DF-1细胞经亚克隆培养、PCR扩增和基因组测序,鉴定到3株缺失6、21、24个碱基的细胞株。以H9N2禽流感病毒感染细胞,RT-qPCR结果显示,KO-6、KO-21、KO-24细胞株的病毒基因组RNA拷贝数显著降低;TCID50测定病毒生长曲线,病毒滴度显著下降;流感病毒双荧光素酶报告系统测定聚合酶活性,结果显示缺失细胞株流感病毒聚合酶活性降低30~3 000倍。研究发现,KO-6、KO-21细胞株抑制AIV复制,KO-24细胞株显著抑制AIV复制,缺失chANP32A 125~132 AA更显著抑制AIV复制。本研究为chANP32A基因功能研究以及研发具有抗禽流感病毒且chANP32A生物学功能不改变的基因编辑鸡奠定了基础。