番茄斑驳花叶病毒 RT-RAA-CRISPR/Cas12a的可视化检测方法的建立

作     者：董铮 赵振兴 范奇璇 王思元 周涛 张永江 

作者机构：中国检验检疫科学研究院 中国农业大学植物保护学院 

出 版 物：《植物病理学报》 (Acta Phytopathologica Sinica)

年 卷 期：2024年

核心收录：

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

基　　金：国家重点研发计划(2021YFD1400100 2021YFD1400103) 

主　　题：番茄斑驳花叶病毒 RT-RAA CRISPR/Cas12a 可视化检测 

摘      要：番茄斑驳花叶病毒（tomato mottle mosaic virus, To MMV）是近年来发现的一种新的烟草花叶病毒属Tobamovirus病毒，主要侵染番茄、辣椒、茄子等茄科作物，严重影响果实的产量和品质。本研究根据To MMV编码外壳蛋白的基因保守序列，设计重组酶介导等温核酸扩增技术（recombinase-aided amplification,RAA）特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）及相关蛋白12a（CRISPR-associated12a,Cas12a）的crRNA并挑选报告基因，通过优化反应体系及特异性和灵敏度的验证，建立了ToMMV快速灵敏的可视化检测方法。优化结果显示，当报告基因FQ终浓度为300 nmol·L-1、Cas12a/crRNA比例为1:5、终浓度为200 nmol·L-1和1 000 nmol·L-1条件下检测效果最好，最终RT-RAA和CRISPR/Cas12a显色体系只需分别反应15 min，通过便携式蓝光照射设备可以直接观察到阳性信号。实际样品检测结果显示，本研究建立的检测技术可以在辣椒和番茄中检测到ToMMV。该方法可特异性检测ToMMV，对携带ToMMV样品的RNA检测灵敏度可达2.5 pg·μL-1，是RT-PCR检测灵敏度的100倍，可用于ToMMV快速灵敏的可视化检测。