重组腺相关病毒装载目的核酸完整性分析

作     者：黄天治 秦玺 于雷 郑祖亮 郭林 史新昌 张怡轩 HUANG Tianzhi;QIN Xi;YU Lei;ZHENG Zuliang;GUO Lin;SHI Xinchang;ZHANG Yixuan

作者机构：沈阳药科大学生命科学与生物制药学院辽宁沈阳117004 中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室北京100050 北京深蓝云生物科技有限公司北京102600 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2024年第37卷第6期

页      面：641-645页

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100704[医学-药物分析学] 10[医学] 

基　　金：国家重点研发计划(2023YFC3403305) 中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金(2023-PT350-01) 

主　　题：重组腺相关病毒 核酸 完整性 数字PCR 重叠 

摘      要：目的探讨重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)装载目的核酸完整性检测方法,并初步建立分析算法。方法消化rAAV外游离DNA片段,提取病毒基因组,设计5对搭接引物,采用正交排列方式,分别用数字PCR仪进行检测,常规条件采用EveGreen和模板4μL的20μL反应体系,数字PCR条件:95℃5 min;95℃15 s,55℃30 s,72℃90 s,45个循环。超长核酸片段增强条件采用Mix B-2000 bp和模板2μL的25μL反应体系,采用仪器附带软件定量。最小二乘法拟合分析共有的全长片段数量,进而解读目的核酸完整性分布情况。结果引物间距离不大于1200 nt的片段可得到有效扩增,经系统分析得到一系列片段长约1000 nt的有效片段拷贝数,最小二乘法拟合分析共有片段拷贝数量,估计样本中全长片段不多于1234 copies/μL,该值与测得的最大值(1443 copies/μL)之间差异有统计学意义(P0.05),差异占比约16.9%。结论初步建立了rAAV装载目的核酸完整性的检测方法,并分析出供试品中存在一定数量的不完整目的核酸,为后续深入研究奠定了基础。