重组人白细胞介素-1受体拮抗剂卡那霉素抗性菌种的构建、表达、纯化及质量鉴定

作     者：殷婷婷 朱秋媚 张宇 王江林 王明军 曲玲玲 朱翯 顾笑宇 刘景会 富锐丽 刘玉林 YIN Tingting;ZHU Qiumei;ZHANG Yu;WANG Jianglin;WANG Mingjun;QU Lingling;ZHU He;GU Xiaoyu;LIU Jinghui;FU Ruili;LIU Yulin

作者机构：长春生物制品研究所有限责任公司吉林长春130000 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2024年第37卷第6期

页      面：672-678,686页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 

基　　金：吉林省科技发展计划(20210204092YY) 

主　　题：重组人白细胞介素-1受体拮抗剂 同源重组 抗性基因 菌种变更 

摘      要：目的构建卡那霉素抗性的重组人白细胞介素-1受体拮抗剂(recombinant human interleukin-1 receptor antagonist,rhIL-1Ra)菌种,并进行rhIL-1Ra蛋白的表达、纯化及质量鉴定,以降低β-内酰胺抗生素带来的风险。方法分别以氨苄抗性的质粒rhIL-1Ra(A-rhIL-1Ra)、pET-28a为模板,进行PCR扩增,获得线性化载体和卡那霉素基因片段,经同源重组构建卡那霉素抗性的质粒rhIL-1Ra(K-rhIL-1Ra),测序正确后转化*** BL21(DE3),构建重组工程菌,经IPTG诱导表达后,进行CM Bestarose Fast Flow、DEAE Bestarose Fast Flow两步柱层析纯化。收集纯化产物,15%SDSPAGE、分子排阻高效液相色谱法(size-exclusion high-performance liquid chromatography,SEC-HPLC)、反相高效液相色谱法(reversed-phase high-performance liquid chromatography,RP-HPLC)检测纯度,串联质谱法检测质谱相对分子质量,Western blot法鉴定特异性,报告基因法检测生物学活性,液相色谱-质谱(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)法分析比对产品相关杂质。结果经菌落PCR及测序鉴定证明质粒K-rhIL-1Ra构建正确。表达的K-rhIL-1Ra蛋白相对分子质量约17000,主要以可溶性形式存在,表达量占菌体总蛋白的30%以上;两步纯化的K-rhIL-1Ra蛋白纯度分别为97%和99%,单体含量分别为99.33%和100%,色谱纯度分别为91.86%和96.96%,质谱相对分子质量与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致,可与小鼠抗人IL-1Ra单抗发生特异性反应;纯化的K-rhIL-1Ra蛋白生物学活性为1.29×10^(5)U/mg,相关蛋白化学修饰类型与标准品(A-rhIL-1Ra蛋白)一致。结论成功构建了K-rhIL-1Ra菌种,表达并纯化后的蛋白符合rhIL-1Ra的特征和质量标准,为rhIL-1Ra菌种变更及可比性研究奠定了基础。