敲除CRFK细胞氨基肽酶N对猫传染性腹膜炎病毒复制影响的研究

作     者：陈晓彤 郭慧娟 田进 王洪峰 史鑫琪 陈洪岩 夏长友 王金泉 孟庆文 CHEN Xiao-tong;GUO Hui-juan;TIAN Jin;WANG Hong-feng;SHI Xin-qi;CHEN Hong-yan;XIA Chang-you;WANG Jin-quan;MENG Qing-wen

作者机构：新疆农业大学动物医学学院新疆乌鲁木齐830000 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室国家禽类实验动物资源库黑龙江哈尔滨150069 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪消化道传染病创新团队黑龙江哈尔滨150069 

出 版 物：《中国预防兽医学报》 (Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine)

年 卷 期：2024年第46卷第3期

页      面：306-313页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：国家重点研发计划课题(2022YFF0710501) 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610302022018) 兽医生物技术国家重点实验室资助项目(SKLVBP 202101、SKLVBP202120) 

主　　题：氨基肽酶N 猫传染性腹膜炎病毒 猫肾细胞 

摘      要：猫氨基肽酶N(fAPN)参与猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的感染过程,为研究f APN对FIPV复制的影响,本研究针对f APN第14外显子设计了1对sg RNA,将sg RNA退火后克隆至p X458质粒中,构建同时含有Cas9蛋白和sg RNA的重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,瞬时转染猫肾细胞(CRFK)中,24 h后通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的单克隆细胞。单克隆细胞经稳定传代培养后,细胞中的绿色荧光消失,对细胞进行PCR和测序,结果显示:3株单克隆细胞在f APN第14外显子有1个碱基的插入,造成移码突变,导致f APN不能正常表达,表明敲除f APN蛋白的CRFK细胞系正确构建,命名为KO-APN14。将FIPV分别感染CRFK细胞及培养20代的KO-APN14细胞,48 h后通过间接免疫荧光试验(IFA)检测FIPV N蛋白的表达;将FIPV分别感染CRFK细胞及KO-APN14细胞,在感染4 h、12 h、24 h、36 h时采用RT-q PCR分别检测FIPV N基因、视黄酸(维甲酸)诱导基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、Toll样受体3(TLR3)、干扰素β(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)的转录水平。IFA结果显示:感染FIPV的CRFK细胞出现绿色荧光,未感染FIPV的CRFK细胞、未感染FIPV的KO-APN14细胞及感染FIPV的KO-APN14细胞均无绿色荧光;RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后病毒N基因的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够极显著抑制FIPV N基因的转录(P0.0001);RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后上述各细胞因子的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够抑制RIG-I、MDA5、TLR3、IFN-β、IL-6、IL-10、TNF-α及f APN的转录。综上所述,f APN是FIPV在侵入细胞及病毒复制过程中发挥重要作用,并在FIPV引起的炎症反应过程中起关键作用。本研究为f APN在免疫炎症反应中作用的研究提供科学依据,并为培育基因编辑抗病育种猫奠定实验基础。