基于CRISPR/Cas9技术的SIRT3基因敲除猪肺泡巨噬细胞系的构建与鉴定

作     者：王宝鑫 张文华 董霞 郑好 张晶 陈洪波 周傲 

作者机构：武汉轻工大学动物科学与营养工程学院/动物遗传繁育与精准养殖实验室 湖北省家畜种业技术创新中心 

出 版 物：《江西农业大学学报》 (Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis)

年 卷 期：2024年第4期

页      面：991-1000页

核心收录：

学科分类：090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：国家自然科学基金项目（81902073）~~ 

主　　题：猪肺泡巨噬细胞系 SIRT3 CRISPR/Cas9 炎症反应 抗病育种 基因编辑 

摘      要：【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系，分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用，为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，针对猪SIRT3基因第2号外显子设计sgRNA，连接pb-U6-puro-BFP质粒后转染3D4/21细胞，筛选单克隆细胞，结合Sanger测序、qPCR和Western blot技术对获得的单克隆细胞进行鉴定，进而获得SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21-SIRT3-KO），并以流感病毒A/WSN/33为研究对象，感染野生型和3D4/21-SIRT3-KO猪肺泡巨噬细胞，利用qPCR方法检测炎症相关因子IL-6、IL-8的表达水平，初步分析SIRT3基因在流感病毒感染诱导炎症反应的影响。【结果】Sanger测序结果显示，在挑选获得的敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞克隆中，SIRT3基因第2号外显子位点产生了碱基缺失，并导致移码突变；同时，利用qPCR和Western blot检测猪肺泡巨噬细胞中SIRT3 mRNA和蛋白水平的表达，结果显示与野生型细胞相比，3D4/21-SIRT3-KO细胞中SIRT3mRNA和SIRT3蛋白均不表达；流感病毒感染SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞时发现，敲除SIRT3能显著加剧流感病毒感染诱导的炎症反应。【结论】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系，并初步分析了SIRT3在流感病毒感染中作用。