重组酶聚合酶扩增技术检测南美白对虾急性肝胰腺坏死病

作     者：金东升 漏懿荣 王瑶华 段丽君 李其昂 陈琛 闫茂仓 陈炯 周前进 JIN Dong-Sheng;LOU Yi-Rong;WANG Yao-Hua;DUAN Li-Jun;LI Qi-Ang;CHEN Chen;YAN Mao-Cang;CHEN Jiong;ZHOU Qian-Jin

作者机构：宁波大学农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室 宁波大学海洋学院 浙江省海洋水产养殖研究所浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室 

出 版 物：《农业生物技术学报》 (Journal of Agricultural Biotechnology)

年 卷 期：2024年第32卷第4期

页      面：961-973页

核心收录：

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

基　　金：浙江省公益技术研究计划/农村农业(LGN22C010001) 浙江省重点研发项目(2021C02059) 国家自然科学基金(42276110) 宁波市科技特派员项目(2022S210) 浙江省“三农九方”农业科技协作计划项目(2023SNJF062) 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室开放基金(J2022001) 宁波大学One health交叉学科研究项目(HZ202201) 温州市基础性科研项目(S2020020) 

主　　题：重组酶聚合酶技术(RPA) 急性肝胰腺坏死病(AHPND) pirA pirB 检测 

摘      要：急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是一种新近出现的对虾(Penaeidae)细菌性疾病，给世界范围内的对虾养殖业造成了巨大的经济损失。AHPND主要由携带毒力基因pirA和pirB的弧菌(Vibrio spp.)引起。本研究以pirA和pirB为检测靶标，分别设计和筛选特异性引物和探针，建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)方法。RPA反应在39℃下进行，反应时间设定为20 min。结果显示，针对pirA和pirB基因分别筛选到1套引物/探针组合。应用该引物/探针组合对RPA方法进行系列测试，发现引物/探针组合均能够特异性检出目标毒力基因，对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)，以及虾肝肠孢虫(Enterocytozoon hepatopenaei)等13种微生物的基因组DNA未出现扩增。灵敏度实验结果发现，使用pirA的引物/探针组合最低能够稳定检测出0.01 fg/μL的重组质粒pirAB-pMD19，而使用pirB的引物/探针组合最低能够稳定检测出0.1 fg/μL的重组质粒pirAB-pMD19。经优化，检测pirA和pirB的RPA反应的最优引物浓度为0.4μmol/L，探针浓度为0.16μmol/L。使用优化的引物/探针组合对可疑南美白对虾(Penaeus vannamei)组织样品利用RPA方法进行检测，结果显示，利用建立的RPA方法能够准确地从对虾组织样品中检测到pirA和pirB，综合检测结果与世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health, WOAH)推荐的PCR方法结果一致。综上，本研究分别针对pirA和pirB建立的PRA方法能够快速、准确地检出ANPND病原，而且操作简便、耗时短，有望成为AHPND病害日常监测和快速检测的重要补充。