INTU-siRNA质粒的构建及在人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞中的筛选

作     者：闫淑鑫 张淑静 袁慧敏 孙逸卓 骈雪 孙燕 汤阳 YAN Shu-xin;ZHANG Shu-jing;YUAN Hui-min;SUN Yi-zhuo;PIAN Xue;SUN Yan;TANG Yang

作者机构：北京中医药大学中医学院北京102488 

出 版 物：《现代生物医学进展》 (Progress in Modern Biomedicine)

年 卷 期：2024年第24卷第6期

页      面：1001-1006,1043页

学科分类：1002[医学-临床医学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 08[工学] 09[农学] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金项目(82004337) 中央高校基本科研业务费自主选题(2020-JYB-XJSJJ-002) 

主　　题：INTU-si RNA质粒 人甲状腺Nthy-ori-3-1细胞 Graves病 

摘      要：目的:构建人源靶向特异INTU-si RNA质粒,转染人源性甲状腺Nthy-ori-3-1细胞以构建INTU基因沉默的Nthy-ori-3-1细胞模型,为探索Graves病的发病机制提供合适的细胞模型。方法:构建四对人源INTU序列(编号分别为INTU-29、INTU-31、INTU-33、INTU-35)si RNA质粒和空载体质粒,将空载体和四对INTU-si RNA质粒分别转染Nthy-ori-3-1细胞培养24 h,通过倒置荧光显微镜观察质粒转染细胞后的荧光表达,使用多功能酶标仪检测荧光强度,通过荧光定量PCR法验证INTU基因的沉默效率,通过蛋白质免疫印迹法验证各组细胞内INTU蛋白的表达水平,筛选沉默INTU基因效率最佳的质粒。结果:空载体和INTU-si RNA质粒转染入Nthy-ori-3-1细胞24 h后,倒置荧光显微镜和荧光酶标仪检测结果显示空载体和四组INTU-si RNA组呈现绿色的荧光表达,与正常组相比,空载体与四组INTU-si RNA组的荧光强度均显著高于正常组(P0.01),提示质粒均转染成功。荧光定量PCR结果显示,与正常组和空载体组相比,四组INTU-si RNA组的INTU基因m RNA相对表达量均显著降低(P0.01),其中INTU-35组表达降低最显著,INTU的m RNA表达降低了61.02%。蛋白质免疫印迹法结果显示,与正常组和空载体相比,INTU-29组和INTU-31组并无显著降低,INTU-33和INTU-35组较正常组和空载体组明显下降(P0.05,P0.01),其中INTU-35组最佳,INTU的蛋白表达降低了44.54%。以上结果提示INTU-35组沉默INTU基因效果最佳。结论:本研究成功构建INTU-si RNA质粒,并将该质粒成功转染人源甲状腺Nthy-ori-3-1的细胞模型。INTU-si RNA甲状腺细胞模型的构建,为进一步探索Graves病的发病机制奠定了实验基础。