肺泡上皮细胞条件培养基对血管内皮细胞损伤的影响

作     者：杨静帆 李海博 秦燕勤 李建生 Yang Jingfan;Li Haibo;Qin Yanqin;Li Jiansheng

作者机构：河南中医药大学中医药科学院郑州450046 河南中医药大学、河南省中医药防治呼吸病重点实验室、呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心郑州450046 河南中医药大学第一附属医院呼吸与危重症医学科郑州450003 

出 版 物：《中华危重病急救医学》 (Chinese Critical Care Medicine)

年 卷 期：2024年第36卷第2期

页      面：160-165页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(82104662, 81973822) 河南省科技攻关项目(222102310141) 河南省高等学校重点科研项目(22A360007) 河南省博士后科研项目(202101046) 

主　　题：慢性阻塞性肺疾病 条件培养基共培养法 肺泡上皮细胞 血管内皮细胞损伤 炎症反应 蛋白激酶B/核转录因子-κB通路 

摘      要：目的观察脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞条件培养基对血管内皮细胞炎症反应及细胞损伤的影响,探讨其机制。方法以LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)条件培养基为刺激物,建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤模型。采用细胞增殖与毒性检测试剂盒(CCK-8)检测0%(空白组)、12.5%、25%、50%、75%、100%不同浓度A549细胞条件培养基培养6、12、24和48 h对HUVEC活性的影响;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测A549细胞条件培养基对HUVEC炎症因子〔白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)〕、血管活性物质〔血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素-1(ET-1)〕水平的影响;鬼笔环肽染色法观察A549细胞条件培养基对HUVEC形态的影响;蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测A549细胞条件培养基对HUVEC蛋白激酶B/核转录因子-κB(AKT/NF-κB)通路相关蛋白表达的影响。结果与空白组相比,12.5%、25%、50%浓度的A549细胞条件培养基作用6、12、24 h对HUVEC活性无影响,作用48 h后HUVEC活性显著降低,故选择12.5%、25%、50%浓度A549细胞条件培养基作用24 h为诱导条件进行后续实验。与空白组比较,12.5%和50%条件培养基组IL-6水平显著升高(ng/L:2?438.95±64.89、3?036.41±96.69比1?736.75±20.99,均P0.05),12.5%和25%条件培养基组TNF-α水平显著升高(ng/L:174.08±11.09、81.37±8.17比50.03±0.26,均P0.01),12.5%、25%和50%条件培养基组VEGF、ET-1水平均显著升高〔VEGF(ng/L):173.60±41.44、192.49±12.38、318.89±27.90比66.68±19.65,ET-1(ng/L):54.88±1.37、36.69±0.29、24.07±0.73比10.67±0.25,均P0.01〕。鬼笔环肽染色结果显示,25%浓度A549细胞条件培养基诱导的HUVEC细胞形态不规则,大小不均匀,排列紊乱,间隙变宽,微丝结构密集且不清晰,细胞膜呈锯齿样;25%条件培养基组鬼笔环肽染色的细胞荧光强度较空白组显著增加(67?205.60±3?430.40比56?272.67±7?650.95,P0.05)。Western blotting结果显示,与空白组比较,12.5%、25%、50%条件培养基组HUVEC磷酸化NF-κB抑制因子α(p-IκBα)表达显著降低(p-IκBα/IκBα:0.38±0.08、0.67±0.12、0.31±0.07比1.00±0.00,均P0.01),磷酸化AKT(p-AKT)、VEGF表达显著升高(p-AKT/AKT:1.50±0.18、1.42±0.27、1.61±0.14比1.00±0.00,EGF/GAPDH:1.37±0.10、1.53±0.22、1.40±0.12比1.00±0.00,均P0.05),25%条件培养基组磷酸化NF-κB p65(p-P65)表达显著升高(p-P65/P65:1.45±0.14比1.00±0.00,P0.05)。结论 LPS诱导的肺泡上皮细胞条件培养基可通过激活AKT/NF-κB通路诱导内皮细胞损伤。