lncRNA-MSTRG.7889.1竞争性结合bta-miR-146a靶向Smad4调控牦牛颗粒细胞的凋亡

作     者：孟朝轶 王运路 姚一龙 席广银 牛家强 索朗斯珠 郭敏 徐业芬 MENG ZhaoYi;WANG YunLu;YAO YiLong;XI GuangYin;NIU JiaQiang;SOLANGSIZHU;GUO Min;XU YeFen

作者机构：西藏农牧学院动物科学学院 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 中国农业大学动物科学技术学院 

出 版 物：《中国农业科学》 (Scientia Agricultura Sinica)

年 卷 期：2024年第57卷第4期

页      面：797-809页

核心收录：

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

基　　金：国家自然科学基金(31960661) 西藏自治区科技厅区域科技协同创新专项(QYXTZX-NQ2022-04) 国家肉牛牦牛产业体系项目(CARS-37) 

主　　题：lncRNA bta-miR-146a 凋亡 颗粒细胞 牦牛开放科学(资源服务)标识码(OSID): 

摘      要：【背景】卵泡颗粒细胞（Granulosa cells,GCs）凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因，竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA）机制已被证明参与调控GCs的凋亡过程。前期牦牛卵巢转录组测序发现lnc RNA-MSTRG.7889.1与bta-mi R-146a具有结合位点，而bta-mi R-146a和Smad4存在靶向关系。【目的】通过探究影响牦牛卵泡GCs凋亡的ce RNA分子调控机制，为揭示牦牛生殖调控的奥秘奠定基础。【方法】采集和分离成年母牦牛的健康和闭锁卵泡，利用RT-q PCR法检测lnc RNA-MSTRG.7889.1、bta-mi R-146a和Smad4在卵泡中的表达。制作牦牛健康和闭锁卵泡组织切片，TUNEL检测健康卵泡和闭锁卵泡中GCs的凋亡情况；荧光原位杂交分析lnc RNA-MSTRG.7889.1、bta-mi R-146a和Smad4在卵泡中的定位。体外分离和培养牦牛GCs，分别转染Smad4过表达载体和bta-mi R-146a mimics，流式细胞术检测GCs细胞凋亡率，Western blot检测促凋亡蛋白CASPASE3和BAX，抑凋亡蛋白BCL-2的表达；GCs共转染Smad4过表达载体和bta-mi R-146a mimics后，探究bta-mi R-146a是否靶向Smad4影响牦牛GCs的凋亡。将lnc RNA-MSTRG.7889.1过表达慢病毒载体感染GCs，流式细胞术和Western blot检测lnc RNA-MSTRG.7889.1对GCs凋亡的影响；lnc RNA-MSTRG.7889.1载体和bta-mi R-146a mimics共转染GCs，进一步分析lnc RNA-MSTRG.7889.1是否竞争性结合bta-mi R-146a靶向Smad4影响牦牛GCs的凋亡。【结果】lnc RNA-MSTRG.7889.1和Smad4 m RNA在牦牛健康卵泡中的表达极显著高于闭锁卵泡（P0.01），而bta-mi R-146a的表达则相反（P0.01）。TUNEL检测结果显示，在闭锁卵泡中GCs的荧光强度极显著高于健康卵泡（P0.01），说明闭锁卵泡中GCs凋亡显著高于健康卵泡。荧光原位杂交结果显示Smad4、bta-mi R-146a和lnc RNA-MSTRG.7889.1在牦牛卵泡中共表达，其在健康和闭锁卵泡中的表达与RT-q PCR结果基本一致，提示可能存在ce RNA机制参与牦牛健康卵泡发育和卵泡闭锁过程。在牦牛GCs过表达Smad4使细胞凋亡率显著降低（P0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低（P0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高（P0.01）；过表达bta-mi R-146a使GCs凋亡率显著升高（P0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著升高（P0.01),BCL-2蛋白的表达显著降低（P0.01);bta-mi R-146a靶向抑制Smad4的表达（P0.01);Smad4和bta-mi R-146a共转染GCs，结果显示bta-mi R-146a靶向抑制Smad4降低前者对GCs凋亡的促进作用（P0.01）。过表达lnc RNA-MSTRG.7889.1使牦牛GCs凋亡率显著降低（P0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低（P0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高（P0.01);lnc RNA-MSTRG.7889.1显著抑制bta-mi R-146a的表达（P0.01）。将lnc RNA-MSTRG.7889.1和bta-mi R-146a共转染GCs，结果表明lnc RNA-MSTRG.7889.1靶向bta-mi R-146a降低后者对GCs凋亡的促进作用（P0.01）；而且RT-q PCR法和Western blot检测结果表明lnc RNA-MSTRG7889.1竞争性结合bta-mi R-146a促进Smad4 m RNA和蛋白水平的表达（P0.01）。【结论】lnc RNA-MSTRG.7889.1竞争性结合bta-mi R-146a促进Smad4的表达抑制牦牛GCs的凋亡。