lncRNA-MSTRG.7889.1竞争性结合bta-miR-146a靶向Smad4调控牦牛颗粒细胞的凋亡
lncRNA-MSTRG.7889.1 Competitively Binds to bta-miR-146a Targeting Smad4 to Regulate Apoptosis of Yak Granulosa Cells作者机构:西藏农牧学院动物科学学院 中国农业科学院深圳农业基因组研究所 中国农业大学动物科学技术学院
出 版 物:《中国农业科学》 (Scientia Agricultura Sinica)
年 卷 期:2024年第57卷第4期
页 面:797-809页
核心收录:
基 金:国家自然科学基金(31960661) 西藏自治区科技厅区域科技协同创新专项(QYXTZX-NQ2022-04) 国家肉牛牦牛产业体系项目(CARS-37)
主 题:lncRNA bta-miR-146a 凋亡 颗粒细胞 牦牛开放科学(资源服务)标识码(OSID):
摘 要:【背景】卵泡颗粒细胞(Granulosa cells,GCs)凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因,竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA)机制已被证明参与调控GCs的凋亡过程。前期牦牛卵巢转录组测序发现lnc RNA-MSTRG.7889.1与bta-mi R-146a具有结合位点,而bta-mi R-146a和Smad4存在靶向关系。【目的】通过探究影响牦牛卵泡GCs凋亡的ce RNA分子调控机制,为揭示牦牛生殖调控的奥秘奠定基础。【方法】采集和分离成年母牦牛的健康和闭锁卵泡,利用RT-q PCR法检测lnc RNA-MSTRG.7889.1、bta-mi R-146a和Smad4在卵泡中的表达。制作牦牛健康和闭锁卵泡组织切片,TUNEL检测健康卵泡和闭锁卵泡中GCs的凋亡情况;荧光原位杂交分析lnc RNA-MSTRG.7889.1、bta-mi R-146a和Smad4在卵泡中的定位。体外分离和培养牦牛GCs,分别转染Smad4过表达载体和bta-mi R-146a mimics,流式细胞术检测GCs细胞凋亡率,Western blot检测促凋亡蛋白CASPASE3和BAX,抑凋亡蛋白BCL-2的表达;GCs共转染Smad4过表达载体和bta-mi R-146a mimics后,探究bta-mi R-146a是否靶向Smad4影响牦牛GCs的凋亡。将lnc RNA-MSTRG.7889.1过表达慢病毒载体感染GCs,流式细胞术和Western blot检测lnc RNA-MSTRG.7889.1对GCs凋亡的影响;lnc RNA-MSTRG.7889.1载体和bta-mi R-146a mimics共转染GCs,进一步分析lnc RNA-MSTRG.7889.1是否竞争性结合bta-mi R-146a靶向Smad4影响牦牛GCs的凋亡。【结果】lnc RNA-MSTRG.7889.1和Smad4 m RNA在牦牛健康卵泡中的表达极显著高于闭锁卵泡(P0.01),而bta-mi R-146a的表达则相反(P0.01)。TUNEL检测结果显示,在闭锁卵泡中GCs的荧光强度极显著高于健康卵泡(P0.01),说明闭锁卵泡中GCs凋亡显著高于健康卵泡。荧光原位杂交结果显示Smad4、bta-mi R-146a和lnc RNA-MSTRG.7889.1在牦牛卵泡中共表达,其在健康和闭锁卵泡中的表达与RT-q PCR结果基本一致,提示可能存在ce RNA机制参与牦牛健康卵泡发育和卵泡闭锁过程。在牦牛GCs过表达Smad4使细胞凋亡率显著降低(P0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低(P0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高(P0.01);过表达bta-mi R-146a使GCs凋亡率显著升高(P0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著升高(P0.01),BCL-2蛋白的表达显著降低(P0.01);bta-mi R-146a靶向抑制Smad4的表达(P0.01);Smad4和bta-mi R-146a共转染GCs,结果显示bta-mi R-146a靶向抑制Smad4降低前者对GCs凋亡的促进作用(P0.01)。过表达lnc RNA-MSTRG.7889.1使牦牛GCs凋亡率显著降低(P0.01),CASPASE3和BAX蛋白的表达显著降低(P0.01),BCL-2蛋白的表达显著升高(P0.01);lnc RNA-MSTRG.7889.1显著抑制bta-mi R-146a的表达(P0.01)。将lnc RNA-MSTRG.7889.1和bta-mi R-146a共转染GCs,结果表明lnc RNA-MSTRG.7889.1靶向bta-mi R-146a降低后者对GCs凋亡的促进作用(P0.01);而且RT-q PCR法和Western blot检测结果表明lnc RNA-MSTRG7889.1竞争性结合bta-mi R-146a促进Smad4 m RNA和蛋白水平的表达(P0.01)。【结论】lnc RNA-MSTRG.7889.1竞争性结合bta-mi R-146a促进Smad4的表达抑制牦牛GCs的凋亡。