刚地弓形虫感染对小鼠脑组织转录本mA甲基化修饰的影响

作     者：解晓曼 孙航 代莉莎 朱文菊 王利磊 谢环环 董宏杰 张俊梅 王琦 周贝贝 赵桂华 徐超 尹昆 

作者机构：山东省寄生虫病防治研究所山东第一医科大学(山东省医学科学院) 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2024年

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

基　　金：山东省自然科学基金（ZR2022MH197） 济宁市重点研发计划（2022YXNS152） 山东省医药卫生科技发展计划（202101050270） 

主　　题：刚地弓形虫 m A修饰 转录本 脑包囊 纳米孔三代测序 

摘      要：目的 分析刚地弓形虫感染对小鼠脑组织转录本的m6A甲基化修饰水平的影响。方法 20只雌性C57BL/6J小鼠随机分为TgCtwh6感染组(7只)、LHG感染组(7只)和对照组(TgCtwh6感染组、LHG感染组的对照各3只)。TgCtwh6感染组、LHG感染组分别灌胃接种中国Ⅰ型wh6株和中国Ⅲ型LHG株刚地弓形虫感染小鼠脑组织悬液0.2 ml (20个包囊/鼠)，对照组灌胃等量的生理盐水。分别在接种后15、30和45 d，用抽签法随机抽取感染组小鼠各1只，麻醉后处死，取脑组织，于显微镜下分别记录大脑皮层区、海马区和嗅球区的包囊数。感染后45 d每组分别取3只小鼠的全脑组织，提取总RNA，制备基因组文库，进行转录组测序，筛选差异甲基化位点(DML)，统计感染组和对照组的mRNA的差异m6A甲基化位点及其所在转录本；对甲基化位点所在转录本进行基因本体功能注释(GO)分析，京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，对甲基化差异转录本进行基因集富集分析(GSEA)。选取甲基转移酶样3 (METTL3)、肥胖相关蛋白(FTO)和YTH结构域3 (YTHDF3)等3种m6A甲基化修饰蛋白基因，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为内参，实时荧光定量逆转录PCR (qRT-PCR)检测其相对转录水平。结果 感染组小鼠均感染成功。感染后45 d，大脑皮层、海马和嗅球的包囊数分别为(5 676±10)、(4 773±9)、(243±10)个。感染组和对照组共检出760 650个甲基化位点，其中GGACA、 GGACC、GGACT、ACGAT等4种m6A的模体的甲基化水平分别占16.8%(127 923/760 650)、4.6%(35 164/760 650)、3.8%(28 983/760 650)和0.4%(3 122/760 650)；共检出高甲基化位点所在转录本127 016条，其中GGACA、GGACC、GGACT和ACGAT所在的转录本分别为71 727、27 754、24 556和2 979条。感染组与对照组小鼠脑组织转录组中ACGAT、GGACA、GGACC、GGACT等4种m6A模体的DML位点总数为9 233，其中高甲基化位点4 832个，低甲基化位点4 851个。GO分析结果显示，DML所在转录本显著富集于生物过程中的细胞过程、细胞组分中的细胞膜和分子功能中的结合等功能；DML所在转录本的KEGG富集分析结果显示，分子间相互作用网络主要富集在多巴胺能突触、谷氨酸能突触、松弛素信号通路、鞘脂信号通路、细菌侵袭上皮细胞、聚糖生物合成、剪接体等途径中；对生物过程的GO富集分析结果显示，DML所在的转录本中，生物过程相关的部分转录本主要富集于蛋白糖基化、神经元凋亡负调控、钙离子信号相应、树突延伸正调控和顺行突触囊泡运输；对照组和两个感染组的组间差异甲基化高分富集于成纤维细胞增殖负调控通路和Hippo信号通路相关的转录本子集中，其中筛选出ENSMUST00000105393、ENSMUST00000006523、ENSMUST00000055261和ENSMUST00000038658等4个关键转录本，分别编码共刺激因子配体(ICOSL)、富含半胱氨酸肠蛋白1 (CRIP1)、MOB激酶激活剂1A201 (MOB1A201)和MOB1A202，与对照组相比，TgCtwh6感染组、LHG感染组的这4个基因表达均上调。qRT-PCR结果显示，TgCtwh6感染组、LHG感染组小鼠脑组织mettl3 mRNA相对表达水平分别为5.47±1.09、1.63±0.06，与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=4.05、5.03，均P 0.05);ythdf3 mRNA相对表达水平分别为3.57±0.08、1.80±0.25，与对照组(1.01±0.11)比较差异均有统计学意义(t=18.95、2.85，均P 0.05);fto mRNA相对表达水平分别为0.41±0.04、0.60±0.12，与对照组(1.00±0.06)比较差异有统计学意义(t=7.67、2.99，均P 0.05);qRT-PCR结果与转录组测序获得的转录趋势一致。结论 弓形虫慢性感染可导致小鼠脑组织转录本m6A甲基化修饰水平升高，并可能通过对icosl、crip1和mob1a等关键差异转录本的修饰调控，造成宿主脑组织内与精神行为相关的生物学进程和信号通路的改变。