印楝素胁迫下草地贪夜蛾幼虫实时荧光定量PCR内参基因表达稳定性评价

作     者：舒本水 黄玉婷 余萱悦 刘翠婷 谢心怡 沈皓 林进添 

作者机构：仲恺农业工程学院/广州市亚热带果树重大疫情控制重点实验室 

出 版 物：《广东农业科学》 (Guangdong Agricultural Sciences)

年 卷 期：2024年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

基　　金：国家自然科学基金项目(32102221) 广东省重点领域研发计划项目(2020B020223004) 大学生创新创业训练计划项目(S202311347039) 

主　　题：实时荧光定量PCR 草地贪夜蛾 印楝素 内参基因 表达稳定性 

摘      要：【目的】实时荧光定量PCR技术是目前研究靶标基因转录水平表达量最为常规和高效的技术之一，其中合适的内参基因选择对于其结果的准确性具有重要意义。本研究拟通过评估印楝素胁迫下草地贪夜蛾幼虫候选内参基因在不同样品中的表达稳定性，确定最适的内参基因，为后续靶标基因功能分析和印楝素分子毒理机制解析提供基础。【方法】本研究选取了草地贪夜蛾α-TUB，β-1-TUB，Actin，EF1α，EF2，GAPDH，RPL3和RPL13 共8个候选内参基因，通过ΔCt，GeNorm，NormFinder，BestKeeper及RefFinder软件对印楝素胁迫下各候选内参基因在幼虫整虫、表皮、中肠、脂肪体和马氏管样品中转录水平表达量的稳定性进行评估，采用GeNorm软件确定最适内参基因数目，确定印楝素胁迫下不同样品中最适内参基因组合。【结果】印楝素胁迫下幼虫样品中，ΔCt和Normfinder分析发现α-TUB和β-1-TUB表达稳定性最高，GeNorm分析发现RPL3和RPL13表达稳定性最高，BestKeeper分析则是α-TUB和RPL13表达稳定性最高。表皮样品中β-1-TUB和α-TUB在ΔCt、GeNorm和Normfinder中被评为表达稳定性最高的基因，Actin和β-1-TUB在BestKeeper评估中最稳定。在中肠组织中，ΔCt分析发现EF2和β-1-TUB表达最稳定，GeNorm发现EF1α和RPL3表达最稳定，Normfinder认为EF2和β-1-TUB表达最稳定，BestKeeper分析发现RPL13和RPL3表达最稳定。在脂肪体组织中，ΔCt、GeNorm和Normfinder分析均认为RPL3和EF1α表达稳定性最高，BestKeeper分析则认为RPL13和RPL3稳定性最高。在马氏管组织样品中，ΔCt分析发现RPL3和EF2表达最稳定，GeNorm评估EF1α和EF2表达最稳定，Normfinder认为β-1-TUB和EF2表达最稳定，BestKeeper分析发现RPL13和β-1-TUB表达最稳定。此外，GeNorm软件分析发现各样品中最适内参基因数目均为2个。因此，通过RefFinder综合分析评估认为α-TUB 和 β-1-TUB在幼虫和表皮组织样品中表达稳定性最高；EF2和RPL3在幼虫中肠和马氏管组织样品中表达稳定性最高；RPL3和EF1α在脂肪体组织样品中表达稳定性最高。【结论】印楝素胁迫下草地贪夜蛾幼虫和表皮中最适内参基因组合为α-TUB 和 β-1-TUB；幼虫中肠和马氏管组织样品中最适内参基因组合为EF2和RPL3；脂肪体组织样品中最适内参基因组合为RPL3和EF1α。