致牛腹泻主要病毒四重PCR检测方法的建立与初步应用

作     者：李沫萱 钟林翰 韩言言 张晓梅 刘伊湄 张梦媛 王美 徐义刚 李园 LI Moxuan;ZHONG Linhan;HAN Yanyan;ZHANG Xiaomei;LIU Yimei;ZHANG Mengyuan;WANG Mei;XU Yigang;LI Yuan

作者机构：浙江农林大学动物科技学院·动物医学院浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室杭州311300 

出 版 物：《黑龙江畜牧兽医》 (Heilongjiang Animal Science And veterinary Medicine)

年 卷 期：2024年第4期

页      面：67-75页

学科分类：0907[农学-林学] 090705[农学-野生动植物保护与利用] 09[农学] 

主　　题：牛病毒性腹泻病毒 牛冠状病毒 牛轮状病毒 牛细小病毒 四重PCR检测方法 

摘      要：为了建立能同时检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛轮状病毒(BRV)和牛细小病毒(BPV)的四重PCR方法,试验首先分别以BVDV 5′-UTR、BCoV Nsp10、BRV VP6和BPV VP2为靶基因设计检测引物,然后通过优化退火温度、Mg^(2+)体积、rTaq酶体积、dNTPs Mix体积和上下游引物体积建立致牛腹泻主要病毒的四重PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、灵敏度和重复性评价,最后应用该方法对临床样本进行检测。结果表明:所建立的四重PCR方法的最优退火温度为55.2℃,最优Mg^(2+)体积为3.0μL,最优rTaq酶体积为0.8μL,最优dNTPs Mix体积为2.5μL,BVDV、BRV、BcoV和BPV对应基因最优的上下游引物分别为1.3μL/1.3μL、0.7μL/0.7μL、1.3μL/1.3μL和0.8μL/0.8μL。该方法仅对靶标病毒检测为阳性,对其他牛源病毒[牛副流感病毒3型(BPIV3)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)]和口蹄疫病毒(FMDV)灭活疫苗检测均为阴性;对BVDV、BCoV、BRV和BPV的最低检出限分别为1.0×10^(3)copies/μL、1.0×10^(3)copies/μL、1.0×10^(4)copies/μL和1.0×10^(3)copies/μL;对3个批次样本的各个重复均能扩增出目的基因;可准确检测出牛粪便样本组合中已知的病毒;对临床样本中4种病毒的检出率与商品化病毒核酸检测试剂盒的检测结果具有较好的一致性。说明本研究建立的致牛腹泻主要病毒四重PCR检测方法能同时检测BVDV、BCoV、BRV和BPV,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于临床样本的检测。