神经干细胞与RPE细胞的线粒体交换及其对RPE细胞增生和能量代谢的影响

作     者：孙荣莎 徐海伟 阴正勤 Sun Rongsha;Xu Haiwei;Yin Zhengqin

作者机构：第三军医大学西南医院全军眼科中心重庆市视觉损伤与再生修复重点实验室重庆400038 

出 版 物：《中华实验眼科杂志》 (Chinese Journal Of Experimental Ophthalmology)

年 卷 期：2015年第33卷第5期

页      面：424-429页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

基　　金：国家重点基础研究发展计划项目（973计划,2013CB967002） 国家自然科学基金项目（31271051） 志谢感谢黎其友、曾玉晓在实验中对流式检测及细胞培养给予的技术支持与帮助 

主　　题：干细胞 眼色素上皮/细胞学 视网膜变性/治疗 细胞培养 共培养技术 线粒体/代谢 隧道纳米管 动物 

摘      要：背景 研究表明,干细胞可通过与损害靶细胞进行线粒体交换的方式修复受损细胞.视网膜色素变性疾病是以视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡为病理基础的眼病,干细胞是否能够通过上述机制进行治疗尚不清楚. 目的 研究神经干细胞（NSCs）能否通过线粒体交换机制改善RPE细胞的增生和能量代谢功能.方法 分离Long-Evans大鼠的视网膜进行RPE细胞的培养和传代,取第3代细胞用于实验,采用荧光显微镜检测RPE细胞中RPE65和Bestrophin蛋白的表达.小鼠NSCs C17.2细胞系和带绿色荧光蛋白（GFP）的C17.2细胞（GFP-C17.2细胞）进行培养和传代.分别采用线粒体特异性染色剂Mitotracker-green和Mitotracker-red标记RPE细胞和NSCs线粒体.将RPE细胞与小鼠NSCs进行共培养,用麦胚凝集素（WGA）标记隧道纳米管（TNT）,于激光扫描共焦显微镜下观察共培养的RPE细胞与小鼠NSCs间TNT中线粒体交换方式;采用流式细胞术检测RPE细胞与NSCs共培养前后的细胞周期改变;采用高效液相色谱（HPLC）技术检测共培养前后RPE细胞中ATP、ADP和AMP的质量分数. 结果 培养的第3代RPE细胞生长良好,RPE65和Bestrophin表达阳性细胞均85％.NSCs和RPE细胞中线粒体对Mitotracker-red标记的阳性率均95％.2种细胞共培养后24 h可见RPE细胞与NSCs间形成的膜性TNT结构,WGA染色呈蓝色荧光.随着时间的推移,NSCs中呈红色荧光的线粒体通过TNT进入呈绿色荧光的RPE细胞中.接受TNT线粒体后,处于G1期的RPE细胞比例较未进行线粒体交换的RPE细胞明显下降,差异有统计学意义（P=0.016）,S期细胞和G2/M期细胞比例分别增加了5％和2％,差异均无统计学意义（P=0.114、0.189）.HPLC检测结果显示,与NSCs共培养后,RPE细胞中ATP、ADP和AMP质量分数分别为（8.77 ±3.68）、（2.76±0.92）和（1.07±0.65） μg/mg,较共培养前的（11.29±2.29）、（3.12±0.95）和（1.59±1.22） μg/mg均有所下降,但差异均无统计学意义（P=0.370、0.668、0.553）.结论 NSCs通过建立的TNT能将线粒体单向传递给共培养的RPE细胞,线粒体交换可能是NSCs改善RPE细胞增生和代谢能力的机制之一.