利用CRISPR/Cas9技术构建人TCRP1基因敲除慢性髓系白血病K562细胞系及其生物学功能检测

作     者：刘孝荣 陈妍 辛泽锋 钟惠锋 蔡思宇 陈运生 Liu Xiaorong;Chen Yan;Xin Zefeng;Zhong Huifeng;Cai Siyu;Chen Yunsheng

作者机构：深圳市儿童医院检验科深圳518038 深圳市儿童医院儿研所深圳518038 深圳市儿童医院血液肿瘤科深圳518038 

出 版 物：《中国医师杂志》 (Journal of Chinese Physician)

年 卷 期：2023年第25卷第8期

页      面：1187-1193页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：广东省基础与应用基础研究基金(2020A1515010246) 深圳市科技计划项目(JCYJ20210324135414039) 

主　　题：K562细胞 白血病,髓系,慢性 基因编辑 基因,TCRP1 

摘      要：目的选取人慢性髓系白血病(CML)细胞K562为实验对象,利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除舌癌耐药相关蛋白1(TCRP1)基因的CML细胞系K562/TCRP1-KO,通过细胞增殖、细胞凋亡、药物敏感性等功能试验比较K562/TCRP1-KO与对照细胞(K562/cas9-CTL)的表型差异,初步探讨TCRP1基因参与CML发病的可能机制。方法在特定位点设计针对TCRP1的小向导RNA(sgRNA),寡核苷酸片段退火后与线性化的Cas9表达载体重组,慢病毒包装系统转染293T细胞,收集纯化病毒感染K562细胞,嘌呤霉素加压筛选阳性多克隆,有限稀释法进一步筛选出单克隆K562/TCRP1-KO,Sanger测序和Western blot检测成功敲除的稳定细胞株,同时构建转染lentiCRISPR载体的K562细胞作为对照细胞株(K562/cas9-CTL),采用细胞计数法、CCK8法及伊马替尼(IM)梯度稀释法、流式细胞术分别对K562/TCRP1-KO和K562/cas9-CTL进行细胞增殖、药物敏感性及细胞凋亡分析。结果成功构建了用于TCRP1敲除的sgRNA-Cas9重组质粒载体,转染293T细胞后,利用有限稀释法成功筛选到TCRP1敲除的单克隆细胞株。与K562/cas9-CTL细胞相比,K562/TCRP1-KO细胞的增殖能力显著减弱,IM药物敏感性显著增强,细胞凋亡进程显著加快(均P0.05)。结论利用CRISPR/Cas9成功构建了TCRP1敲除的CML细胞株,TCRP1可能作为癌症相关基因影响CML细胞的增殖、IM耐药能力及凋亡进程。