基于RPA-LFD法的多黏菌素耐药基因mcr-1可视化快速检测方法建立与应用

作     者：焦雪 董羽织 王靖雯 吕晨泽 方结红 蒋晗 JIAO Xue;DONG Yuzhi;WANG Jingwen;LÜChenze;FANG Jiehong;JIANG Han

作者机构：中国计量大学生命科学学院浙江省特色农产品品质及危害物控制技术重点实验室浙江杭州310018 

出 版 物：《食品工业科技》 (Science and Technology of Food Industry)

年 卷 期：2023年第44卷第18期

页      面：209-216页

核心收录：

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

基　　金：国家自然科学基金(31901792,31801655) 浙江省基础公益研究计划项目(LGN22C200013) 宁波市公益类科技计划项目(2022S014) 萧山区重大科技计划项目(2021226) 浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划(2022R409A050,2022R409A057) 

主　　题：多黏菌素耐药基因 mcr-1 重组酶聚合酶扩增技术 胶体金侧向流试纸条 快速检测 可视 化 定量 

摘      要：目的:建立一种快速、高效、可视化的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1检测方法,为其基层检测的展开提供依据和便利。方法:利用重组酶聚合酶扩增结合胶体金侧向流试纸条技术(Recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick,RPA-LFD),辅以手持式胶体金读数仪;根据mcr-1基因保守序列设计合成一对特异性RPA引物,通过对反应条件和体系的优化,以及特异性试验、灵敏度试验、模拟食样试验和实际样品试验,成功建立了可视化定量检测细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD方法。结果:在引物浓度400 nmol/L,引物比例1:1时,该方法最佳反应条件为Mg^(2+)浓度14.0 mmol/L,反应温度37℃,反应时间20 min;灵敏度好,标准曲线方程为y=0.117x+0.051,定量限为10^(1)~108 copies/μL,检出限为10^(1)copies/μL,比PCR法低一个数量级且模拟样品检出结果与PCR法一致。利用建立的RPA-LFD法对猪肉样品、鸡肉样品、生猪养殖场环境样品、肉鸡养殖场环境样品、大肠杆菌分离株和弯曲肠杆菌分离株各15份中多黏菌素耐药基因mcr-1携带情况进行分析;RPA-LFD法与常规PCR法阳性样本检出率一致,共检出9份mcr-1基因阳性样品。RPA-LFD定量分析显示,阳性样品中mcr-1基因浓度在4.5×10^(2)~8.6×10^(4)copies/μL之间。结论:本研究建立的细菌多黏菌素耐药基因mcr-1的RPA-LFD检测法特异性强、灵敏性高、操作简单,可广泛应用于基层检验。