过表达甲基转移酶样3修复炎症来源牙周膜干细胞的成骨能力

作     者：陈欣 张校晨 秦文 金作林 Xin Chen;Xiaochen Zhang;Wen Qin;Zuolin Jin

作者机构：军事口腔医学国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心陕西省口腔疾病临床医学研究中心空军军医大学第三附属医院口腔正畸科西安710032 

出 版 物：《中华口腔医学研究杂志（电子版）》 (Chinese Journal of Stomatological Research(Electronic Edition))

年 卷 期：2023年第17卷第1期

页      面：15-25页

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81970960、82001079) 国家口腔疾病临床医学研究中心2020年度专项课题(LCA202009) 

主　　题：甲基转移酶样3 N^(6)-甲基腺嘌呤修饰 牙周膜干细胞 成骨分化 

摘      要：目的探讨N^(6)-甲基腺嘌呤(m6A)修饰与甲基转移酶样3(METTL3)在牙周膜干细胞(PDLSC)成骨分化和成脂分化中的作用。方法使用流式细胞术、细胞集落形成实验分别鉴定PDLSC的表面标志物和增殖能力。通过茜素红染色和油红O染色分别检测PDLSC的成骨和成脂分化潜能。在人牙周膜干细胞(hPDLSC)和炎症来源牙周膜干细胞(pPDLSC)中分别构建METTL3过表达和敲低模型,成骨诱导一定时间,通过实时定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot)、茜素红染色和油红O染色分别在mRNA水平、蛋白水平和宏观水平检测成骨和成脂的变化。两样本比较使用独立样本t检验,多组样本比较使用单因素方差分析。结果(1)流式细胞术结果显示,hPDLSC和pPDLSC均阳性表达CD29(100.0%,98.0%)、CD105(100.0%,99.5%)和CD146(31.5%,17.8%),阴性表达CD34(1.3%,0.4%)和CD45(1.4%,0.4%)。(2)细胞集落形成实验结果显示,hPDLSC和pPDLSC的集落形成数量分别为55±5和72±8,hPDLSC的细胞增殖能力较pPDLSC低(t=3.16,P=0.034)。(3)茜素红染色和油红O染色说明,两种细胞均具有成骨和成脂分化能力,hPDLSC具有更强的成骨分化能力(t=27.77,P0.001),而pPDLSC具有更强的成脂分化能力(t=5.02,P=0.007)。(4)成骨诱导培养7 d后的慢病毒转染模型中,METTL3过表达组比过表达对照组的成骨关键基因Runx2的mRNA表达水平高,在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组的表达量是3.63±1.15和1.61±0.38,分别是其过表达对照组的3.39倍(t=3.777,P=0.020)和1.71倍(t=2.948,P=0.042);而在METTL3敲低组较敲低对照组低,在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组的表达量是0.16±0.03和0.26±0.07,分别是其敲低对照组的0.15倍(t=9.669,P0.001)和0.26倍(t=8.767,P0.001)。同样地,Runx2的蛋白表达水平也发生相同改变。将转染后的细胞进行21 d的成骨诱导培养后进行茜素红染色,结果显示METTL3过表达组较过表达对照组染色深且钙化结节较大,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组是28.47%±3.82%和8.55%±0.43%,分别是其过表达对照组的1.78倍(t=5.012,P=0.007)和1.76倍(t=7.293,P=0.002),而在METTL3敲低组较敲低对照组染色浅且钙化结节较小,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组是6.36%±2.00%和3.78%±0.56%,分别是其敲低对照组的0.35倍(t=4.444,P=0.011)和0.43倍(t=5.337,P=0.006);将转染后的细胞进行21 d的成脂诱导培养,再进行油红O染色,结果显示脂滴的大小及数量在METTL3过表达组较过表达对照组少,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3过表达组是0.89%±0.11%和1.10%±1.15%,分别是其过表达对照组的0.24倍(t=5.454,P=0.006)和0.49倍(t=2.935,P=0.043),而在METTL3敲低组则比敲低对照组的脂滴更大且多,定量分析结果显示在hPDLSC和pPDLSC中的METTL3敲低组是3.60%±1.08%和5.34%±1.31%,分别是其敲低对照组的1.94倍(t=2.794,P=0.049)和2.93倍(t=4.131,P=0.015)。结论pPDLSC的METTL3表达水平低于hPDLSC;METTL3的过表达可促进hPDLSC和pPDLSC的成骨分化,并抑制两者的成脂分化。