重组蛋白中甘氨酸、组氨酸含量柱前衍生反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

作     者：张小雪 梁舒静 王惠欣 王辉 ZHANG Xiaoxue;LIANG Shujing;WANG Huixin;Wang Hui

作者机构：华北制药集团新药研究开发有限责任公司抗体药物研制国家重点实验室河北石家庄050015 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2023年第36卷第7期

页      面：844-849页

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

基　　金：河北省科技重大专项(21282401Z) 

主　　题：柱前衍生-反相高效液相色谱法 甘氨酸 组氨酸 含量 

摘      要：目的 建立定量检测重组蛋白中甘氨酸、组氨酸含量的柱前衍生反相高效液相色谱法(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC),并进行验证。方法 选用AccQ Tag-C18(3.9 mm×150 mm,4μm)色谱柱,以6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基甲酸酯(6-aminoquinolyl-N-hydroxysccinimidyl carbamate,AQC)为柱前衍生化试剂,α-氨基丁酸为内标,AccQTag Eluent A液、乙腈溶液、超纯水为流动相,紫外检测波长为248 nm,进样量为10μL,流速为1.0 mL/min,柱温为37℃。内标法计算样品中甘氨酸、组氨酸含量,并对该方法专属性、线性、检测限、定量限、精密度、准确度和稳定性进行验证。结果 建立的方法可将甘氨酸、组氨酸和内标α-氨基丁酸有效分离,专属性强。甘氨酸在2.25~11.25μg/mL范围内,组氨酸在72.85~364.24μg/mL范围内,标准曲线线性良好,R^(2)均0.99。检测限为:甘氨酸2.25μg/mL,组氨酸18.21μg/mL。定量限为:甘氨酸4.69μg/mL,组氨酸32.86μg/mL。甘氨酸、组氨酸同浓度6份样品重复性验证结果的RSD分别为4.6%和5.0%,中间精密度试验回收率的RSD分别为6.9%和2.0%。甘氨酸含量接近定量限,其高、中、低浓度样品平均回收率为75.9%~111.7%;组氨酸回收率为88.9%~97.3%。同1份样品在0、12、18、24、30、48 h甘氨酸含量的RSD为7.7%,组氨酸含量的RSD为3.3%。结论 柱前衍生RP-HPLC法精密度高,结果准确可靠,可对重组蛋白中的甘氨酸、组氨酸含量进行质量控制。