5种主要海水养殖病原菌多重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立

作     者：徐媛媛 于永翔 王印庚 王春元 李永杰 刘定远 秦蕾 张正 XU Yuanyuan;YU Yongxiang;WANG Yingeng;WANG Chunyuan;LI Yongjie;LIU Dingyuan;QIN Lei;ZHANG Zheng

作者机构：江苏海洋大学江苏连云港222005 农业农村部海水养殖病害防治重点实验室、中国水产科学研究院黄海水产研究所山东青岛266071 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食品产出过程功能实验室山东青岛266071 

出 版 物：《渔业科学进展》 (Progress in Fishery Sciences)

年 卷 期：2023年第44卷第3期

页      面：222-234页

核心收录：

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

基　　金：国家重点研发计划课题(2019YFD0900104) 山东省自然科学基金项目(ZR2020QC216 ZR2021MC027) 江苏省研究生科研与实践计划项目(SJCX20_1288)共同资助。 

主　　题：哈维氏弧菌 副溶血弧菌 大菱鲆弧菌 鳗弧菌 美人鱼发光杆菌美人鱼亚种 微流控PCR 现场快速检测 

摘      要：在养殖现场开展多病原的快速检测是水产养殖产业健康发展的重要技术需求之一。本研究选取哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的vhhA基因、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的toxR基因、大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)的luxR基因、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的empA基因和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种(Photobacterium damselae subsp.damselae)的Mcp基因作为靶基因,设计特异性引物,通过优化反应体系和条件,并在微流控芯片进行集成,建立了可同步检测这5种病原菌的多重微流控荧光定量PCR检测技术。结果显示,本研究所建立的检测技术最佳反应体系:2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 5μL,Primer F/R各1μL,DNA模板2μL,ddH_(2)O 1μL。反应条件为95℃30 s,95℃5 s,61℃30 s,扩增30个循环。通过绘制标准曲线发现,在10^(9)~10^(4)copies/μL浓度范围内均有良好的线性相关性。该方法对哈维氏弧菌、副溶血弧菌、大菱鲆弧菌、鳗弧菌和美人鱼发光杆菌美人鱼亚种特异性强,对5种病原菌的最低检测限分别为40、20、200、500和20 CFU/mL,显示出较高的灵敏度,且样品平均检测时间缩短至26 min左右。本研究结果为开发水产养殖多病原快速、精准的现场检测技术奠定了重要基础。