甘氨酸对经烧伤大鼠血清干预的大鼠心肌细胞的作用及其机制

作     者：吕尚军 闫尊东 范荣辉 彭曦 Lyu Shangjun;Yan Zundong;Fan Ronghui;Peng Xi

作者机构：武警陕西省总队医院烧伤整形科西安710086 西安碑林天嗣综合门诊部西安710003 陕西省人民医院烧伤整形医学美容外科西安710068 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院临床医学研究中心重庆400038 

出 版 物：《中华烧伤与创面修复杂志》 (Chinese Journal of Burns And Wounds)

年 卷 期：2023年第39卷第5期

页      面：434-442页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(81971838)。 

主　　题：烧伤 甘氨酸 肌细胞,心脏 能量代谢 微管 细胞保护 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路 

摘      要：目的探讨甘氨酸对经烧伤大鼠血清(以下简称烧伤血清)干预的大鼠心肌细胞的作用及其机制。方法采用实验研究方法。取30只7~8周龄雌雄各半Wistar大鼠,其中10只用于制备正常大鼠血清(以下简称正常血清),将另20只造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清;从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法(分组方法下同)将细胞分为用相应血清处理的正常血清组、烧伤血清组,于处理1、3、6、9、12 h进行锥虫蓝染色检测细胞存活率;将细胞分为用烧伤血清处理6 h后常规培养30 min的单纯烧伤血清组和用烧伤血清处理6 h后加相应终物质的量浓度甘氨酸培养30 min的0.4 mmol/L甘氨酸组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组、2.0 mmol/L甘氨酸组,即干预6.5 h,同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组,分别同前干预6.5 h,采用高效液相色谱法检测腺苷一磷酸(AMP)和ATP含量并计算AMP/ATP比值,采用蛋白质印迹法检测磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(p-mTORC1)、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶(p-p70 S6K)、磷酸化真核翻译起始因子4E结合蛋白1(p-4E-BP1)、磷酸化AMP活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白表达。将细胞分为同前干预的正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组和用烧伤血清处理后加2种试剂培养的0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组,于处理1、3、6 h行相应培养30 min,即干预1.5、3.5、6.5 h,采用免疫荧光法检测热休克蛋白70(HSP70)、金属硫蛋白(MT)和微管蛋白表达并观察干预6.5 h微管形态。各时间点样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、LSD检验及Bonferroni校正。结果处理1、3、6、9、12 h,烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组(t值分别为4.96、16.83、35.51、34.33、27.88,P0.05)但明显高于处理12 h(P0.05);选择处理6 h作为后续烧伤血清干预时间。干预6.5 h,与单纯烧伤血清组比较,各甘氨酸组细胞存活率均明显升高(P0.05)。0.8 mmol/L甘氨酸组细胞存活率最高,选择0.8、1.2、1.6 mmol/L作为后续甘氨酸的干预浓度。干预6.5 h,单纯烧伤血清组细胞AMP/ATP比值较正常血清组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组明显升高(P值均0.05),1.6 mmol/L甘氨酸组细胞AMP/ATP比值较0.8 mmol/L甘氨酸组明显降低(P0.05)。干预6.5 h,正常血清组、单纯烧伤血清组、0.8 mmol/L甘氨酸组、1.2 mmol/L甘氨酸组、1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K、p-4E-BP1蛋白表达水平分别为1.001±0.037、0.368±0.020、1.153±0.019、1.128±0.062、1.028±0.037,0.96±0.07、0.63±0.12、1.17±0.13、1.13±0.16、1.11±0.11,0.98±0.06、0.45±0.08、1.13±0.05、0.77±0.12、0.51±0.13。与单纯烧伤血清组比较,正常血清组与各甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-p70 S6K和p-4E-BP1蛋白表达均明显升高(P0.05),p-AMPK蛋白表达均明显降低(P0.05);与0.8 mmol/L甘氨酸组比较,1.2 mmol/L甘氨酸组细胞p-4E-BP1蛋白表达以及1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1与p-4E-BP1蛋白表达均明显降低(P0.05);与1.2 mmol/L甘氨酸组比较,1.6 mmol/L甘氨酸组细胞p-mTORC1、p-4E-BP1蛋白表达均明显降低(P0.05),p-AMPK蛋白表达明显升高(P0.05)。与正常血清组比较,单纯烧伤血清组细胞干预1.5、3.5、6.5 h微管蛋白表达均明显降低(P0.05),干预1.5、3.5 h HSP70表达和干预3.5、6.5 h MT表达均明显升高(P0.05);单纯烧伤血清组与0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞干预1.5、3.5、6.5 h HSP70、MT表达以及干预1.5、3.5 h微管蛋白表达均明显低于0.8 mmol/L甘氨酸组(P0.05)。干预6.5 h,与正常血清组比较,单纯烧伤血清组细胞微管结构紊乱;0.8 mmol/L甘氨酸组细胞边界较单纯烧伤血清组清晰,微管结构近核部位排列整齐;与0.8 mmol/L甘氨酸组比较,0.8 mmol/L甘氨酸+25 ng/mL雷帕霉素组细胞边界不清,微管结构紊乱。结论烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损,甘氨酸可通过AMP活化蛋白激酶显著上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/p70核糖体蛋白S6激酶/真核翻译起始因子4E结合蛋白1信号通路,促进心肌细胞保护性蛋白HSP70、MT和微管蛋白合成,稳定微管结构,实现心肌细胞保护作用。