tRNA-sgRNA/Cas9系统介导多年生黑麦草原生质体的基因编辑

作     者：姚佳明 郝欢欢 张敬 徐彬 YAO Jia-ming;HAO Huan-huan;ZHANG Jing;XU Bin

作者机构：南京农业大学草业学院江苏南京210095 

出 版 物：《草业学报》 (Acta Prataculturae Sinica)

年 卷 期：2023年第32卷第4期

页      面：129-141页

核心收录：

学科分类：090503[农学-草业科学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

基　　金：国家自然科学基金(31971757)资助。 

主　　题：CRISPR/Cas9 tRNA 多基因编辑 载体 质粒 原生质体 多年生黑麦草 

摘      要：tRNA可以将多个sgRNAs连接起来合并成一个多顺反子基因,再与CRISPR/Cas9表达载体结合形成多顺反子tRNA-sgRNA/Cas9(PTG/Cas9)系统来对多靶点进行基因编辑。该系统已经在水稻中验证其可促进sgRNAs的转录和提高多靶点的编辑效率。因此,为了在多年生黑麦草中实现高效的基因编辑,本研究中,构建了2个带有tRNA的CRISPR中间载体,并提供了一种快速、灵活的PTG/Cas9载体构建方法。为了快速验证PTG/Cas9系统是否可以在多年生黑麦草基因组中发挥功能,用聚乙二醇4000(PEG 4000)介导PTG/Cas9质粒转化多年生黑麦草原生质体,后提取原生质体DNA扩增目的序列检测是否有目标基因被编辑的细胞。试验结果显示,PTG/Cas9系统可用于多年生黑麦草基因编辑,且基因编辑效率约为6.7%。试验结果为多年生黑麦草遗传研究和育种提供了重要的基础。