含人脐血来源富血小板血浆的三维生物打印墨水在裸鼠全层皮肤缺损治疗中的应用

作     者：宋薇 李曌 朱世钧 张超 姚斌 孔毅 梁莉婷 恩和吉日嘎拉 付小兵 黄沙 Song Wei;Li Zhao;Zhu Shijun;Zhang Chao;Yao Bin;Kong Yi;Liang Liting;Enhejirigala;Fu Xiaobing;Huang Sha

作者机构：解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组织再生研究中心北京100048 

出 版 物：《中华烧伤与创面修复杂志》 (Chinese Journal of Burns And Wounds)

年 卷 期：2022年第38卷第10期

页      面：905-913页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

基　　金：国家重点研发计划(2017YFC1103303) 国家自然科学基金青年科学基金项目(32000969) 上海王正国创伤医学发展基金会生长因子复兴计划(SZYZ-TR-03)。 

主　　题：生物相容性材料 打印,三维 新生血管化,生理性 生物墨水 人脐血来源富血小板血浆 创面修复 

摘      要：目的探讨含人脐血来源富血小板血浆(HUCB-PRP)的海藻酸钠-明胶(AG)生物墨水(称为HUCB-PRP-AG生物墨水)的可打印性能和细胞相容性,及该生物墨水的三维打印组织治疗裸鼠全层皮肤缺损创面的效果。方法采用实验研究方法。制备含体积分数2.5%、5.0%、10.0%HUCB-PRP的HUCB-PRP-AG生物墨水,分别命名为1P-AG、2P-AG、4P-AG。取AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG,观察室温下外观,采用旋转流变仪检测黏度、储能模量和损耗模量。利用以上4种生物墨水分别进行三维生物打印并观察打印组织外观(后续使用交联后打印组织),将4种打印组织分别与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在Transwell小室内用HUVEC专用培养基共培养24 h,采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖水平(样本数为3);将4种打印组织分别用DMEM培养基培养12、24、48 h,进行干燥称重并计算降解率(样本数为3);将1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织分别用磷酸盐缓冲液培养0.5、24.0、48.0 h,采用酶联免疫吸附测定法检测培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的表达(样本数为5)。取16只6~8周龄雌性BALB/c-NU裸鼠建立背部全层皮肤缺损创面模型,分为创面仅覆盖医用水胶体敷料的常规对照组和另予HUCB-PRP滴加的HUCB-PRP组、AG打印组织覆盖的AG组、4P-AG打印组织覆盖的4P-AG组(每组4只),观察每组3只裸鼠伤后4、8、14 d创面愈合情况并计算创面愈合率;取每组剩余裸鼠伤后8 d创面组织,行苏木精-伊红染色后观察组织病理学改变,行免疫组织化学染色后观察CD31阳性新生血管情况。对数据行重复测量方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。结果在室温下,AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG均呈半透明液态;AG为淡黄色,1P-AG、2P-AG、4P-AG均为淡红色但颜色依次逐渐加深。在温度10℃和剪切率0.1~10.0 s-1范围内,AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG的黏度均随着剪切率的增加而减小;在温度10℃和角频率1~100 rad/s范围内,4种生物墨水的储能模量均大于损耗模量。4种生物墨水打印组织的分辨率与形态均相近。与1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平分别为0.885±0.030、1.126±0.032、1.156±0.045,均明显高于与AG打印组织共培养的HUVEC的0.712±0.019(P0.01);与2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平均明显高于与1P-AG打印组织共培养的HUVEC(P0.01)。1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织培养12、24、48 h的降解率均明显高于AG打印组织(P0.01);2P-AG、4P-AG打印组织培养24、48 h的降解率均明显高于1P-AG打印组织(P0.01);4P-AG打印组织培养12 h的降解率明显高于1P-AG打印组织(P0.01),培养24、48 h的降解率均明显高于2P-AG打印组织(P0.01)。培养0.5、24.0、48.0 h,2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显高于1P-AG打印组织(P0.01),1P-AG和2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显低于4P-AG打印组织(P0.01)。常规对照组与HUCB-PRP组裸鼠伤后8 d创面较伤后4 d干燥且缩小,HUCB-PRP组裸鼠伤后14 d创面较常规对照组缩小且无结痂;AG组、4P-AG组裸鼠伤后4 d创面上打印组织明显降解且创面无明显渗出,伤后8 d创面明显上皮化且缩小,伤后14 d创面无结痂;4P-AG组裸鼠伤后14 d创面完全上皮化。与常规对照组比较,AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率明显降低(P0.05),HUCB-PRP组、4P-AG组裸鼠伤后各时间点及AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高(P0.01);与HUCB-PRP组比较,AG组裸鼠伤后4、8 d及4P-AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率均明显降低(P0.01),AG组裸鼠伤后14 d及4P-AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高(P0.01);4P-AG组裸鼠伤后各时间点创面愈合率均明显高于AG组(P0.01)。伤后8 d,常规对照组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管,HUCB-PRP组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、丰富新生微血管以及较多CD31阳性新生血管,AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管,4P-AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、大量新生微血管以及大量CD31阳性新生血管。结论HUCB-PRP-AG生物墨水具备良好的可打印性能和细胞相容性,其三维打印组织可促进裸鼠全层皮肤缺损创面血管化,加速创面愈合。