基于腺相关病毒血清型8型介导的Gjb2基因c.109G>A纯合突变耳聋小鼠的基因治疗

作     者：成桢哲 金晨曦 冯宝怡 郑晓飞 刘祎晴 吴皓 陶永 CHENG Zhenzhe;JIN Chenxi;FENG Baoyi;ZHENG Xiaofei;LIU Yiqing;WU Hao;TAO Yong

作者机构：上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科上海200011 上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室上海200125 上海交通大学医学院耳科学研究所上海200125 

出 版 物：《上海交通大学学报（医学版）》 (Journal of Shanghai Jiao tong University:Medical Science)

年 卷 期：2022年第42卷第6期

页      面：735-741页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100213[医学-耳鼻咽喉科学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金重点项目(81730028)。 

主　　题：腺相关病毒 缝隙连接蛋白β2 支持细胞 呋塞米 基因治疗 

摘      要：目的·探究腺相关病毒血清型8型(adeno-associated virus serotype 8,AAV8)介导的野生型缝隙连接蛋白β2(gap junction proteinβ2,Gjb2)基因在Gjb2基因c.109GA纯合突变小鼠(简称Gjb2纯合突变小鼠)耳蜗支持细胞区域的表达情况及安全性,以及对呋塞米引起的听力下降的影响。方法·将带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的AAV8-GFP病毒,经耳蜗中阶注射入新生Gjb2纯合突变小鼠的内耳,注射14 d后取小鼠耳蜗,荧光显微镜观察基底膜GFP的表达情况。将载有野生型Gjb2基因的AAV8-GJB2-GFP病毒经中阶注射入新生Gjb2纯合突变小鼠内耳后,于4周后通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测耳蜗Gjb2 mRNA及其编码的连接子蛋白(connexin 26,CX26)的表达水平,通过免疫荧光法观察其具体表达位置。通过听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)实验评价新生纯合突变小鼠中阶注射AAV8-GJB2-GFP后4周龄时5.66~45.00 kHz的听力阈值。采用呋塞米试验比较野生型小鼠及Gjb2纯合突变小鼠腹腔注射呋塞米前后的ABR阈值变化,以及观察Gjb2纯合突变小鼠经AAV8-GJB2-GFP治疗后能否缓解呋塞米导致的听力下降。结果·AAV8-GFP注射14 d后耳蜗顶圈、中圈、底圈支持细胞的转染率分别为(11.60±1.28)%、(10.33±1.55)%、(5.40±0.86)%。AAV8-GJB2-GFP注射4周后耳蜗Gjb2 mRNA水平约为未注射耳的1.26倍(P=0.014),CX26蛋白水平是未注射耳的1.31倍(P=0.001);注射后通过荧光显微镜观察到耳蜗支持细胞表达CX26,内毛细胞区域也有CX26异位表达。ABR检测显示,给药耳各频率听力阈值与对侧耳无明显差异,表明其安全性较好。Gjb2纯合突变小鼠经呋塞米诱导后较野生型小鼠产生更明显的听力阈移,注射AAV8-GJB2-GFP 4周后突变小鼠阈移小于未治疗小鼠,在8.00、11.32、16.00 kHz测得的阈值,2组间差异均有统计学意义(均P0.05)。结论·在新生Gjb2纯合突变小鼠中阶注射AAV8-GJB2-GFP,可使小鼠成年后耳蜗支持细胞表达外源性Gjb2,挽救呋塞米诱导的听力下降。