肝母细胞瘤表达BRD4的促肿瘤机制及靶向抑制研究

作     者：蔡晨宇 徐曼 冀淑勤 许文凤 贺新月 曹鲜 周红玲 Cai Chenyu;Xu Man;Ji Shuqin;Xu Wenfeng;He Xinyue;Cao Xian;Zhou Hongling

作者机构：重庆医科大学病理教研室重庆医科大学病理诊断中心重庆400016 

出 版 物：《中华小儿外科杂志》 (Chinese Journal of Pediatric Surgery)

年 卷 期：2022年第43卷第7期

页      面：623-629页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主　　题：肝肿瘤 肝母细胞瘤 溴结构域蛋白4 Yes相关蛋白1 JQ1 长春新碱 

摘      要：目的探讨溴结构域蛋白4 (bromodomain-containing protein 4, BRD4)促进肝母细胞瘤(hepatoblastoma, HB)机制及靶向抑制效应。方法收集未经化疗的45例HB穿刺活检或手术切除组织石蜡标本。将未经化疗的45例具有特征性肿瘤细胞的组织石蜡标本作为HB组;在45例石蜡标本中有30例组织边缘可见瘤旁肝组织肝小叶结构正常、可见小叶中央静脉和汇管区的组织, 该30例作为瘤旁对照组。采用免疫组织化学半定量检测BRD4的表达水平, 并对BRD4的表达水平与患儿临床病理特点的相关性进行统计学分析。运用实时定量聚合酶链反应(quantificational real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)、蛋白质印迹法和免疫荧光技术检测人HB细胞株HepG2对照组(未经处理的HepG2细胞)、空载组(转染Si-NC的HepG2细胞)以及Si-BRD4敲低组(转染Si-BRD4的HepG2细胞)的BRD4表达水平, 检测Yes相关蛋白1 (Yes-associated protein 1, YAP1)和c-Myc的mRNA和蛋白表达水平。运用CCK-8法和流式细胞术分别检测HepG2对照组和Si-BRD4敲低组的细胞活力和凋亡率。使用JQ1、长春新碱(vincristine, VCR)、JQ1联合VCR分别处理HepG2细胞48 h后, 通过CCK-8法、EDU-555细胞增殖试剂盒和TUNEL染色检测各组细胞的活力、增殖能力及凋亡率。将使用30 nmol/L JQ1干预的HepG2细胞作为JQ1组, 将使用70 μg/ml VCR干预的HepG2细胞作为VCR组, 将使用30 nmol/L JQ1和70 μg/ml VCR干预的HepG2细胞作为JQ1联合VCR组。结果①免疫组织化学检测结果显示BRD4在HB细胞核阳性率为97.8%(44/45), 瘤旁肝细胞核阳性率为0, 差异具有统计学意义(P0.001 )。②根据美国儿童肿瘤协作组(Children’’s Oncology Group, COG)分期, Ⅰ~Ⅱ期低表达8例, 高表达4例, Ⅲ~Ⅳ期低表达3例, 高表达30例, BRD4表达水平与肿瘤的COG分期有关(P0.001)。低表达患儿无转移发生, 高表达患儿转移11例, BRD4表达水平与肿瘤转移相关(P=0.042)。③qRT-PCR检测结果显示YAP1和c-Myc的mRNA表达水平在Si-BRD4敲低组较HepG2对照组和空载组明显下降;蛋白质印迹法及免疫荧光检测结果也显示YAP1和c-Myc的蛋白表达水平在Si-BRD4敲低组较HepG2对照组和空载组显著下降。④CCK-8法检测结果显示HepG2细胞48 h的光密度(optical density, OD)值在Si-BRD4敲低组明显低于HepG2对照组, 0.423±0.015比0.532±0.026, 细胞活力明显下降, 两组之间的差异具有统计学意义(t=5.03, P= 0.007)。流式细胞术检测结果显示SiRNA敲低BRD4处理48 h后, Si-BRD4敲低组HepG2细胞的凋亡率为(24.58±3.95)%, 显著高于HepG2对照组的(6.46±2.13)%, 差异具有统计学意义(t=7.13, P=0.002)。⑤CCK-8检测结果显示JQ1组、VCR组和JQ1联合VCR组的HepG2细胞活力较HepG2对照组显著降低, 分别为0.364±0.020、0.383±0.014、0.269±0.019和0.943±0.014, 和HepG2对照组之间的差异均具有统计学意义(P0.001), JQ1联合VCR组细胞的活力低于JQ1组和VCR组, 分别为0.269±0.019、0.364±0.020、0.383±0.014, 差异具有统计学意义, (t=5.88, P=0.004)和(t= 8.26, P=0.002)。EDU检测结果显示运用JQ1、VCR及JQ1联合VCR分别作用于HepG2细胞后, 明显抑制了HepG2细胞增殖, 提升了细胞凋亡率, JQ1联合VCR对细胞增殖的抑制和细胞凋亡的促进作用更明显。TUNEL染色结果显示JQ1联合VCR用药的细胞凋亡率高于单独使用JQ1和VCR。结论 BRD4在HB中高表达且与肿瘤的COG分期及转移相关, 可通过YAP1、c-Myc发挥促肿瘤作用, JQ1联合VCR用药作用效果强于单独使用JQ1和VCR。