海分枝杆菌embA低表达菌株的构建及巨噬细胞侵染实验

作     者：李烨雨 刘含梅 黄滢睿 郭滨 张鹭 LI Yeyu;LIU Hanmei;HUANG Yingrui;GUO Bin;ZHANG Lu

作者机构：复旦大学生命科学学院微生物学与免疫学系上海200438 复旦大学遗传工程国家重点实验室上海200082 复旦大学基础医学院上海200030 复旦大学生命科学学院实验教学中心上海200438 

出 版 物：《复旦学报（自然科学版）》 (Journal of Fudan University：Natural Science)

年 卷 期：2023年第62卷第5期

页      面：585-594页

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

基　　金：“十四五”国家重点研发计划(2021YFC2301500) 

主　　题：海分枝杆菌 embA 巨噬细胞 髓样分化因子88 F-actin 

摘      要：通过CRISPRi基因编辑技术构建阿拉伯糖基转移酶基因A(embA)低表达海分枝杆菌突变株,利用qRT-PCR技术检测相关基因转录水平。突变株侵染巨噬细胞后,台盼蓝染色测定细胞存活率,稀释涂布法检测胞内活菌数量。免疫荧光染色观察感染后巨噬细胞中F-actin细胞骨架重排和吞噬小泡的形成。分别通过Western blot和细胞因子悬液芯片方法验证小鼠巨噬细胞J774A.1胞内髓样分化因子88(Myeloid Differenti-ation factor,MyD88)表达量和细胞因子分泌。结果显示:对数生长中期野生型海分枝杆菌中glfT2和embA基因表达量增加。embA低表达突变株中embB,glfT2等6个阿拉伯半乳聚糖合成基因显著下调,但菌体形态和长度不变。与对照菌株相比,突变株侵染J774A.1巨噬细胞24 h后,细胞存活率和胞内CFU上升,吞噬小泡和骨架蛋白无明显变化。胞内MyD88蛋白表达水平增加,分泌性炎症因子TNF-α、IL-6和趋化因子RANTES、MIP-1α水平上升。本研究提示,embA表达量下降会降低海分枝杆菌的细胞毒力,但不会直接改变巨噬细胞吞噬病原菌的生理过程。