新型冠状病毒核蛋白抗原含量ELISA检测方法的建立及验证

作     者：王文辉 宫立孟 林凤杰 李伟 王凯文 杨东升 郭靖 孟胜利 王泽鋆 申硕 WANG Wen-hui;GONG Li-meng;LIN Feng-jie;LI Wei;WANG Kai-wen;YANG Dong-sheng;GUO Jing;MENG Sheng-li;WANG Ze-jun;SHEN Shuo

作者机构：武汉生物制品研究所有限责任公司湖北武汉430207 国家联合疫苗工程技术研究中心湖北武汉430207 武汉药品医疗器械检验所湖北武汉430207 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2022年第35卷第8期

页      面：968-973,980页

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：国家科技攻关计划(2020YFC0842100) 湖北省重点研发计划(2020BCB041) 湖北省科技重大专项(2021ACB005) 

主　　题：重症急性呼吸综合征冠状病毒2 核蛋白 单克隆抗体 ELISA 抗原检测 

摘      要：目的制备抗重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)多克隆抗体和抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N蛋白)单克隆抗体,建立针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,并对该方法进行验证。方法将SARS-CoV-2灭活病毒纯化抗原免疫日本大耳白兔制备兔多克隆抗体;免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株,经蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)和间接ELISA法筛选获得抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体。采用过碘酸钠氧化法对单克隆抗体5E11进行标记,偶联HRP分子,用方阵滴定法对包被抗体(50~800 ng/孔)和酶标抗体(1∶500~1∶8000)的工作浓度进行优化,建立SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,确定方法线性范围和最低检测限,并对其准确度、精密度、耐用性、特异性进行验证。用建立的方法检测3批SARS-CoV-2灭活疫苗工艺过程阶段样品中N蛋白抗原含量。结果选择高效价的SARS-CoV-2兔抗血清纯化后的多克隆抗体作为包被抗体,特异性强的单克隆抗体5E11作为酶标抗体,包被抗体最佳工作浓度为100 ng/孔,酶标抗体最佳工作浓度为1∶1000,建立了针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法。该方法在1.6~200 WU/mL范围内,抗原含量与对应的A450/A630呈良好的线性关系,R20.99,最低检出限为1.6 WU/mL;高、中、低(100、50、25 WU/mL)浓度SARS-CoV-2内部参考品检测均值回收率分别为104.33%、101.33%和98.67%,CV分别为7.06%、7.47%和12.39%;重复性验证CV为8.54%,中间精密度验证CV为8.37%;耐用性验证回收率在88%~112%之间;该方法可特异性识别SARS-CoV-2全病毒Virion、重组N蛋白,与其他抗原均无交叉反应。结论成功建立了SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,该方法具有良好的线性相关性,准确度、精密度、特异性良好,可用于SARS-CoV-2灭活疫苗中N蛋白抗原含量的检测。