盐胁迫条件下杜梨叶片差异表达基因qRT-PCR内参基因筛选

作     者：张秋悦 刘昌来 于晓晶 杨甲定 封超年 ZHANG Qiuyue;LIU Changlai;YU Xiaojing;YANG Jiading;FENG Chaonian

作者机构：南京林业大学南方现代林业协同创新中心南京林业大学生物与环境学院南京210037 南京林业大学竹类研究所南京210037 

出 版 物：《园艺学报》 (Acta Horticulturae Sinica)

年 卷 期：2022年第49卷第7期

页      面：1557-1570页

核心收录：

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

基　　金：江苏省农业科技自主创新资金项目[CX(16)1005] 

主　　题：杜梨 内参基因 实时荧光定量PCR分析 基因表达稳定性 

摘      要：为了准确评价盐胁迫下杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge.)目标基因表达量,筛选q RT-PCR适用内参基因。利用杜梨的全基因组注释信息和转录组测序数据,选择Actin2(Chr15.g01351)、EF1α-1(Chr3.g19898)、EF1α-2(Chr4.g38173)、EF2(Chr5.g06899)、GAPDH-1(Chr16.g30426)、GAPDH-2(Chr13.g23532)、TUBB(Chr5.g06472)、UBQ(Chr4.g40121)等8个候选基因,设计Actin2、EF1α-1、EF1α-2A、EF1α-2B、EF2、GAPDH-1、GAPDH-2、TUBB-A、TUBB-B、UBQE等10对qRT-PCR引物。首先对10对引物的扩增效率进行了测定,再以200 mmol·L^(-1)的NaCl溶液对两个杜梨家系(盐城和连云港)幼苗进行0、24、48、72 h盐胁迫处理。提取叶片的总RNA,反转录合成cDNA,使用10对引物进行q RT-PCR扩增,根据扩增产物使用delta Ct、BestKeeper、geNorm和NormFinder等4种评价内参基因稳定性的方法,对10对引物扩增产物的稳定性进行分析,并使用RefFinder软件对4种评价方法进行综合分析,以确定最稳定内参基因及其引物。利用筛选出的2对最优内参基因引物对(TUBB-A和GAPDH-1)对1个可能参与杜梨盐胁迫响应的HKT基因(Chr16.g29024)的表达情况进行分析,8个候选内参基因的FPKM值(Fragments PerKilobase Million)都大于30,不同盐处理时间下的FPKM变异系数为0.087~0.260;10对荧光定量PCR引物的扩增效率在91.82%~112.99%之间,其中引物对TUBB-A和GAPDH-1的扩增效率最接近于100%;稳定性分析显示10对引物扩增产物的稳定性排序为GΑPDH-1、TUBB-Α、EF1α-1、TUBB-B、EF1α-2Α、EF2、UBQE、GΑPDH-2、Αctin2、EF1α-2B;不同引物对(TUBB-Α、TUBB-B和EF1α-2Α、EF1α-2B)对同一基因的扩增产物的稳定性存在明显差异;利用TUBB-A和GAPDH-1分析HKT基因的表达趋势没有差别。说明基因GΑPDH和TUBB适于作为杜梨盐胁迫下进行荧光定量PCR的内参基因,对应的GAPDH-1、TUBB-A引物对的扩增效果最好。