基于HPLC探讨升降散通过IL-6/JAK2/STAT3信号通路对EAE小鼠的防治作用

作     者：吕保江 郑泽泉 郑可男 吴璐璐 许浩游 童培珍 吴文平 吴智兵 招远祺 LYU Bao-jiang;ZHENG Ze-quan;ZHENG Ke-nan;WU Lu-lu;XU Hao-you;TONG Pei-zhen;WU Wen-ping;WU Zhi-bing;ZHAO Yuan-qi

作者机构：广州中医药大学第一临床医学院广东广州510405 广州中医药大学第二附属医院广东广州510120 广州中医药大学第一附属医院广东广州510403 广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室广东佛山528244 

出 版 物：《中国中药杂志》 (China Journal of Chinese Materia Medica)

年 卷 期：2022年第47卷第12期

页      面：3361-3371页

核心收录：

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

基　　金：广东省自然科学基金项目(2020A1515010595) 广东省中医院中医药科学技术研究专项(YN2019MJ07)。 

主　　题：升降散 高效液相色谱 实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE) IL-6/JAK2/STAT3通路 

摘      要：建立高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分析升降散(Shengjiang Powder,SJP)中大黄素和姜黄素类等化合物成分,探讨其对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠的防治作用。采用HPLC测定升降散中大黄素和姜黄素类化合物含量;SPF级雌性C57BL/6小鼠72只,随机分为对照组、模型组、升降散低剂量组、升降散中剂量组、升降散高剂量组、阳性对照组。每组12只。除对照组外,其余组小鼠均构造EAE模型。免疫后第1天起,升降散组小鼠分别以升降散灌胃,阳性对照组给予醋酸泼尼松灌胃,对照组和模型组给予等体积超纯水灌胃。记录小鼠一般情况、症状评分及体质量。第21天,取小鼠脑组织,分别采用苏木素-伊红(HE)染色和劳克坚牢蓝(LFB)染色检查脑组织病理变化、免疫组化(IHC)测定髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)水平;蛋白免疫印迹(Western blot)检测闭合蛋白(occludin)、紧密连接蛋白(claudin-5)表达,以及白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、酪氨酸蛋白激酶2(janus kinase 2,JAK2)/信号传导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路蛋白及其磷酸化水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qPCR)检测IL-6、JAK2和STAT3的信使核糖核酸(mRNA)表达水平;最后对SJP中以大黄素、姜黄素为首的6种主要有效成分,采用分子对接验证,评价各化合物分别与IL-6、JAK2和STAT3蛋白的结合效能。结果显示,建立了SJP的HPLC分析方法,其精密度、重复性、稳定性和回收率试验均符合要求。与模型组比较,SJP能降低EAE小鼠Konoz临床症状评分,减轻小鼠脑白质炎症浸润以及髓鞘脱失;同时,提高occludin和claudin-5蛋白的表达;qPCR显示SJP治疗后下调了IL-6、JAK2和STAT3 mRNA表达,Western blot表明SJP组IL-6/JAK/STAT3蛋白及其磷酸化水平与模型组比较明显下调,差异有统计学意义。最后,分子对接显示SJP中以大黄素、姜黄素为首的6种主要有效成分与IL-6、JAK2和STAT3蛋白的结合效能良好。建立的HPLC简便、精确、灵敏度高,可用于SJP中大黄素和姜黄素类化合物含量的同时测定。SJP可能通过抑制IL-6/JAK2/STAT3信号通路,保护血脑屏障,减轻脑组织炎症反应及髓鞘脱失,从而改善EAE的临床症状。