埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆、表达及其体外抗凝血作用

作     者：张霞 颜凤 牟小会 林紫敏 聂映 程金芝 商正玲 吴家红 ZHANG Xia;YAN Feng;MU Xiao-hui;LIN Zi-min;NIE Ying;CHENG Jin-zhi;SHANG Zheng-ling;WU Jia-hong

作者机构：贵州医科大学寄生虫学教研室贵安550025 贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室贵安550025 遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院)检验科遵义563099 贵州医科大学免疫学教研室贵安550025 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2022年第40卷第2期

页      面：153-158,167页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金面上项目(8197081668)。 

主　　题：埃及伊蚊 yellow-c基因 血小板聚集 抗凝血 

摘      要：目的克隆表达埃及伊蚊黄蛋白c(Aael-yellow-c)基因,并探讨rAael-yellow-c蛋白体外抗凝血作用。方法RT-PCR扩增Aael-yellow-c成熟肽基因,纯化后的片段与pEASY-E1载体连接,转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定。0.1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达后,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况。比浊法观察不同浓度rAael-yellow-c蛋白对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集活性影响。手工法检测不同浓度rAael-yellow-c蛋白对人血浆凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)及凝血酶时间(TT)的影响。采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析,组间差异比较采用t检验。结果Aael-yellow-c基因CDS区为1287 bp,含27个氨基酸组成的信号肽,成熟肽序列长1200 bp,编码399个氨基酸。RT-PCR扩增获得Aael-yellow-c基因片段,大小约为1200 bp。菌液PCR、双酶切和测序鉴定显示,pEASYE1-Aael-yellow-c质粒构建成功。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体形式表达;镍柱亲和层析纯化重组蛋白后获得单一条带。Western blotting结果显示,该蛋白可被His-tag抗体和抗rAael-yellow-c蛋白的兔血清多克隆抗体识别。血小板聚集抑制实验结果显示,2083.30、416.66、83.33、16.67和3.33 nmol/L rAael-yellow-c蛋白可抑制由ADP诱导的血小板聚集,差异具有统计学意义(t=7.09、10.39、5.39、10.54和8.93,P0.05)。内外源凝血实验结果显示,与阴性对照组相比,0.12、1.20和12.00μmol/L rAael-yellow-c分别作用于人血浆时,PT分别为13.63~14.10、13.32~14.38和13.55~16.01 s,差异无统计学意义(t=1.33、0.63和1.00,P0.05);APTT分别为32.76~38.46、31.94~41.78和33.34~39.29 s,差异无统计学意义(t=0.47、0.06和0.24,P0.05);TT分别为19.12~21.20、19.7~23.12和21.85~25.30 s,差异无统计学意义(t=0.47、0.24和1.60,P0.05)。结论获得的r Aael-yellow-c蛋白主要通过抑制ADP诱导的血小板聚集作用帮助蚊虫吸血。