黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA耐热突变体的筛选

作     者：李珊珊 刘德海 刁文涛 陈晓飞 权淑静 LI Shanshan;LIU Dehai;DIAO Wentao;CHEN Xiaofei;QUAN Shujing

作者机构：河南省科学院生物研究所有限责任公司河南郑州450008 河南省微生物工程重点实验室河南郑州450008 

出 版 物：《中国酿造》 (China Brewing)

年 卷 期：2022年第41卷第3期

页      面：62-68页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：中原科技创新领军人才项目(214200510011) 河南省科学院杰青人才培养项目(201405005) 

主　　题：甘露聚糖酶 耐热突变体 易错PCR 定点突变 

摘      要：为了改造黑曲霉(Aspergillus niger)来源的β-甘露聚糖酶ManA,获得耐热性高的突变体。利用易错聚合酶链式反应(PCR)技术对构建的表达质粒pGAPZαA-manA进行随机突变,将突变文库转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,表达筛选耐热性高的突变体,并进一步对突变位点进行定点突变,筛选其他耐热性高的突变体。结果表明,ManA的H283R与H283K突变体相对于野生型在耐热性方面有显著提升,75℃加热30 min其相对酶活由26.66%分别提升至76.95%和83.57%;在pH 3.0~9.0的条件下,50℃保存24 h,H283K突变体与野生型的相对酶活均在90%以上,H283R突变体在pH 3.0时的相对酶活下降到了84.72%,两个突变体的最适温度、pH及比酶活与野生型没有明显差异。说明β-甘露聚糖酶ManA的283位组氨酸(H283)对其耐热性较为关键,将该位点突变为精氨酸(R)和赖氨酸(K)时,ManA的耐热性得到显著提升。