稳定表达EGFP-LC3蛋白SH-SY5Y细胞系的构建

作     者：陶美彤 朱伟 舒凡 陈昱 张蓉 谢雅彬 谢伟 巴德仁贵 姜树原 刘晓蕾 邵国 贾小娥 周成江 TAO Meitong;ZHU Wei;SHU Fan;CHEN Yu;ZHANG Rong;XIE Yabin;XIE Wei;BADE Rengui;JIANG Shuyuan;LIU Xiaolei;SHAO Guo;JIA Xiao'e;ZHOU Chengjiang

作者机构：包头医学院基础医学与法医学院内蒙古包头014040 包头医学院神经科学研究所 内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室 包头医学院药学院 包头市第三医院 首都医科大学宣武医院低氧适应转化医学北京市重点实验室 

出 版 物：《包头医学院学报》 (Journal of Baotou Medical College)

年 卷 期：2022年第38卷第1期

页      面：26-30页

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金项目(81901918,81660204) 内蒙古自然科学基金(2019MS08060) 中科院2019年度西部青年学者 2020年中央引导地方发展基金(2020ZY0040) 2017年度内蒙古自治区“草原英才”工程青年创新创业人才(Q2017047) 

主　　题：SH-SY5Y细胞 自噬 EGFP-LC3 稳定细胞系 

摘      要：目的:建立稳定表达微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)与绿色荧光蛋白(EGFP)形成的融合蛋白(EGFP-LC3)的人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞系,验证EGFP-LC3点状聚集物能够实时直观地反映自噬小体和自噬流。方法:以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)的cDNA为模板,克隆LC3,并连接EGFP绿色荧光蛋白。将EGFP-LC3连接入慢病毒载体GV348中,构建慢病毒表达载体EGFP-LC3-GV348。慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),使用3μg/mL嘌呤霉素筛选并处理细胞1月,筛选得到EGFP-LC3稳转系。诱导自噬后,用共聚焦显微镜观察LC3荧光斑点并定量分析。Western blot检测目的蛋白表达情况。结果:经酶切证实,EGFP-LC3-GV348慢病毒表达载体构建正确。在激光共聚焦显微镜下,可以观察到细胞内的绿色荧光EGFP代表的自噬小体,活体染料LysoTracker Red DND-99将溶酶体染成红色荧光,红色荧光与绿色荧光重叠代表自噬溶酶体。无血清诱导自噬后,自噬小体(绿色荧光斑点)明显增加,差异有统计学意义(P0.001)。Western Blot免疫印迹可见EGFP-LC3融合蛋白表达条带。结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的SH-SY5Y细胞系,EGFP-LC3荧光斑点可以直观实时反映自噬囊泡,为进一步探讨神经退行性疾病的自噬机制提供了实验基础。