鳗弧菌(Vibrio anguillarum)核酸适配体的筛选及其结合蛋白的分离鉴定

作     者：郑江 刘慧敏 黄力行 林筱钧 彭雪云 江兴龙 周建传 汤学敏 ZHENG Jiang;LIU Hui-Min;HUANG Li-Xing;LIN Xiao-Jun;PENG Xue-Yun;JIANG Xing-Long;ZHOU Jian-Chuan;TANG Xue-Min

作者机构：集美大学水产学院鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心福建省水产生物育种与健康养殖工程研究中心厦门361021 福建省特种水产配合饲料重点实验室福清350308 

出 版 物：《生物化学与生物物理进展》 (Progress In Biochemistry and Biophysics)

年 卷 期：2022年第49卷第1期

页      面：250-261页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 0908[农学-水产] 07[理学] 09[农学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

基　　金：福建省自然科学基金(2021J01823,2018J01455) 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心开放基金(RE202104,RE201808) 福建省水产生物育种与健康养殖工程研究中心开放基金(DF201901) 福建省特种水产配合饲料重点实验室开放课题(TMKJZ1909)资助项目 

主　　题：核酸适配体 鳗弧菌 高频序列 亲和常数 最大亲和力 结合蛋白 SELEX 丙酮酸脱氢酶 

摘      要：目的鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是水产养殖中的重要条件致病菌,每年给水产养殖业造成巨大的经济损失,研究其致病机制、对其进行快速的检测鉴定是其病害防治的前提和基础。核酸适配体因其高亲和力、高特异性等多种优点,在微生物的靶标分析、检测鉴定以及致病机制等多个领域都呈现出较好的应用潜力。因此,筛选鳗弧菌的核酸适配体,利用核酸适配体对鳗弧菌相关位点进行分析鉴定,不仅能为鳗弧菌的检测鉴定提供一个新的手段,对于探索鳗弧菌相关位点在其病害防治中的作用也具有重要意义。方法以鳗弧菌为靶目标,采用每轮测序的SELEX筛选方法,从高频序列中筛选鳗弧菌的核酸适配体;采用单链DNA浓度法测定核酸适配体的亲和力,研究核酸适配体对鳗弧菌的亲和特异性;采用Origin软件、选择反比例函数(Hyperbola函数)进行非线性拟合,获得核酸适配体的亲和常数(K_(d))和最大亲和力(A_(m));采用磁分离技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离纯化出核酸适配体H5的结合蛋白,通过质谱对该蛋白质进行分析鉴定,并利用Prabi、Phyre2、Psortb 3.0等在线网站分析该结合蛋白的空间结构及其亚细胞位置。结果建立了以高频序列为基础的快速筛选核酸适配体的方法,采用该方法筛选出了一系列对鳗弧菌有较好亲和特异性的核酸适配体(H1、H5、H6、H12、H25、H26、H28、H33、H38和H42),测定了其中6个核酸适配体(H1、H5、H25、H26、H33、H38)的K_(d)和A_(m),相应的K_(d)值分别为(78.77±10.99)、(180.65±23.01)、(121.14±21.43)、(276.42±51.23)、(89.24±10.84)、(167.12±23.73)nmol/L,A_(m)值分别为(229.42±8.35)、(891.04±50.14)、(647.20±41.51)、(720.85±75.35)、(510.65±33.89)、(576.06±38.73)nmol/L。核酸适配体H5的结合蛋白为鳗弧菌中的丙酮酸脱氢酶E1组分,该蛋白质主要位于细胞质中,α螺旋和β折叠结构构成了其主要骨架,环状的无规卷曲结构则大多分布在该蛋白质的外部。并对结合蛋白与核酸适配体的互作区域进行了分析推测。结论以高频序列为基础,采用每轮测序的SELEX筛选方法具有较高的筛选效率;核酸适配体最终的表观亲和力是K_(d)和A_(m)共同作用的结果,A_(m)在核酸适配体的表观亲和力中也发挥着不可忽略的作用;核酸适配体H5可能是通过胞吞等方式进入鳗弧菌内部,与细胞质中的丙酮酸脱氢酶E1组分结合,说明核酸适配体是可以进入细菌内部与相应的靶标结合,这为鳗弧菌病害的防控及新型核酸适配体药物的开发提供了一个新的思路。