‘夏黑’葡萄组织培养、原生质体分离和瞬时表达体系的建立

作     者：吴月燕 陈天池 邱甜 沈乐意 谢晓鸿 WU Yueyan;CHEN Tianchi;QIU Tian;SHEN Leyi;XIE Xiaohong

作者机构：浙江万里学院生物与环境学院浙江宁波315000 浙江万里学院设计艺术与建筑学院浙江宁波315000 

出 版 物：《植物生理学报》 (Plant Physiology Journal)

年 卷 期：2021年第57卷第11期

页      面：2128-2144页

核心收录：

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

基　　金：宁波市科技创新2025重大专项(2019B10015) 浙江省重点研发计划(2021C02053) 

主　　题：葡萄 组织培养 原生质体 瞬时表达 

摘      要：本研究以‘夏黑’葡萄(Vitis vinifera)为实验材料,通过调节不同植物生长调节剂浓度配比,探究‘夏黑’葡萄愈伤组织诱导及生根诱导的最适培养基,并在最适培养基条件下,以无菌苗叶片和绿色、黄绿色愈伤组织为材料,对原生质体提取及转化条件进行优化。结果表明,最适合茎段诱导芽的培养基为MS+1.0mg·L^(-1)6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.02 mg·L^(-1)α-萘乙酸(NAA),最适合茎段愈伤诱导的培养基为MS+1.0mg·L^(-1)6-BA+0.1 mg·L^(-1)NAA,最适合叶柄愈伤诱导的培养基为MS+2.0 mg·L^(-1)6-BA+0.1 mg·L^(-1)NAA,最适合叶片诱导的培养基为MS+2.0 mg·L^(-1)噻苯隆(TDZ)+1.0 mg·L^(-1)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.2 mg·L^(-1)吲哚丁酸(IBA),最适合夏黑葡萄生根诱导的培养基为1/2MS+0.5 mg·L^(-1)IBA。以葡萄无菌苗叶片为最佳原生质体提取材料,在纤维素浓度为30 g·L^(-1)、离析酶浓度为5 g·L^(-1)、果胶酶浓度为4 g·L^(-1)、甘露醇浓度为0.6mol·L^(-1)时,28°C黑暗条件下酶解6 h,抽真空处理50 min后分离的原生质体最为理想。将能表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组质粒pCAMBIA1302利用聚乙二醇4000(PEG4000)介导法转化原生质体后,观察到强烈的绿色荧光信号,表明分离的葡萄原生质体可以用作基因瞬时表达体系;并且当PEG4000浓度为300 g·L^(-1)时,转化效果最佳。利用CRISPR-P工具在葡萄VvZEP基因的第一个外显子中设计了2个sgRNA,通过酶切、PCR重组构建了含有2个靶标位点的靶向于VvZEP基因的CRISPR/Cas9载体pGREBn-VvZEP,为后续基因编辑载体转入葡萄原生质体提供了基础。