刚地弓形虫RH株速殖子体外入侵小鼠巨噬细胞系感染模型的构建

作     者：张丽新 赵桂华 徐超 肖婷 孙慧 李瑾 刘功振 尹昆 ZHANG Li-xin;ZHAO Gui-hua;XU Chao;XIAO Ting;SUN Hui;LI Jin;LIU Gong-zhen;YIN Kun

作者机构：山东省寄生虫病防治研究所山东第一医科大学(山东省医学科学院)济宁272033 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2021年第39卷第4期

页      面：494-500,504页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：山东省自然科学基金联合专项(ZR2018LH016) 山东省医药卫生科技发展计划项目(2017WS103) 山东省泰山学者工程项目(tsqn202103186) 国家自然科学基金(81702026) 山东第一医科大学学术提升计划项目(2019QL005) 山东省医学科学院医药卫生科技创新工程 

主　　题：刚地弓形虫 速殖子 鼠巨噬细胞 人包皮成纤维细胞 

摘      要：目的建立刚地弓形虫(简称弓形虫)RH株速殖子体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7的模型,确定体外快速高效培养速殖子的方法。方法弓形虫RH株速殖子经昆明小鼠传代3次后,经5μm滤膜纯化计数后,与小鼠巨噬细胞RAW264.7、人包皮成纤维(HFF)细胞共培养。RAW264.7细胞与虫体数量比例分别为20:1、10:1、1:1、1:5,HFF细胞与虫体比例为1:1,设无虫对照组。分别于培养后10 min、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、32 h、48 h时间点取样,高倍镜下观察共培养情况,瑞-吉氏染色观察速殖子的黏附入侵细胞情况。将速殖子以1.5×10^(6)个/瓶接种于RAW264.7 T25细胞培养瓶中共培养,待80%假包囊破裂后,收集速殖子并计数,计算速殖子产率。用0.4%台盼蓝染液染色后,计算培养体系的活虫率。回收的弓形虫速殖子继续感染新的RAW264.7细胞,将每代细胞中收集的速殖子以1×10^(6)个/只接种5只健康雌性昆明小鼠,同时以等量的第3代速殖子接种5只健康雌性昆明小鼠作为对照,记录每代小鼠的存活时间。应用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。结果当RAW264.7细胞与虫体比例大于10:1时,共培养24 h时可见细胞边界不清,胞质增加,出现大量小泡;共培养30 h时细胞大量死亡消失,未观察到游离弓形虫;当细胞与虫体比例小于或等于1:1时,共培养24 h时内胞质可见细密小颗粒,未见小泡;共培养30 h时假包囊破裂达90%以上,大量速殖子被释放至培养液中,可观察到速殖子体外发育的完整过程。速殖子与RAW264.7细胞以1:1的比例共培养0.5~1 h,约80%的速殖子侵入细胞,虫体可进入胞质和胞核,2~4 h后假包囊开始形成,8 h可见菊花状假包囊;24 h后假包囊开始破裂,32 h后细胞悬浮不贴壁,大部分假包囊破裂并释放出游离速殖子,虫体形态好,每瓶收获弓形虫速殖子6×10^(8)个,平均活虫率在92%以上。速殖子与HFF细胞共培养,2~4 h虫体基本入侵细胞;8 h后速殖子开始分裂增殖;共培养24 h,可见速殖子分裂成菊花状;36 h后细胞开始涨破,释放出的速殖子开始新一轮入侵HFF细胞。体外培养各代弓形虫速殖子对昆明小鼠的平均致死时间为3.94~4.10 d,经与昆明小鼠体内传代复毒虫株相比毒力未见减弱。结论采用小鼠巨噬细胞RAW264.7可在体外培养快速获得大量弓形虫RH株速殖子,产率为体内培养方法的400倍,且虫体毒力与体内培养方法相当,培养时间和产率上也均优于HFF细胞系。