重组泛素连接酶SH2-U—box／RING的构建与表达

作     者：茹懿 李瑗春 王秦豪 钟代星 李霞 RU Yi;LI Yuanchun;WANG Qinhao;ZHONG Daixing;LI Xia

作者机构：第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室肿瘤生物学国家重点实验室西安市710032 

出 版 物：《医学分子生物学杂志》 (Journal of Medical Molecular Biology)

年 卷 期：2012年第9卷第1期

页      面：6-10页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金(No.30800492 30873003 30972723) 

主　　题：泛素 慢性粒细胞白血病 重组质粒 

摘      要：目的构建重组泛素连接酶SH2-U—box、SH2-RING，并克隆进入pFlag—CMV4真核表达载体，为研究靶向降解慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia，CML）患者瘤细胞中过度活化的BCR／ABL，抑制肿瘤细胞的生长提供基础。方法设计引物，扩增接头分子Grb2的SH2结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U—box、Cb1的RING结构域，通过重组PCR，将SH2分别与U—box、RING进行融合，融合片段双酶切之后插入真核表达载体pFlag—CMV4，经过酶切鉴定及测序后，转染HEK293T细胞，Western印迹验证重组质粒的表达。结果PCR结果提示SH2-U—box条带大小888bp，SH2一RING大小为633bp，重组质粒酶切鉴定和测序结果均正确，转染后可见融合蛋白的表达。结论成功构建真核重组表达载体pFlag—CMV4-SH2-U—box和pFlag—CMV4-SH2-RING，转染HEK293T细胞后能够正确表达，为后续研究奠定了基础。