蜜蜂残翼病毒TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

作     者：王琛 马跃宇 黄思超 孙莉 李明 韩喜彬 高志峰 费东亮 马鸣潇 WANG Chen;MA Yueyu;HUANG Sichao;SUN Li;LI Ming;HAN Xibin;GAO Zhifeng;FEI Dongliang;MA Mingxiao

作者机构：锦州医科大学实验动物中心锦州121000 辽宁省农业发展服务中心沈阳110015 

出 版 物：《病毒学报》 (Chinese Journal of Virology)

年 卷 期：2021年第37卷第3期

页      面：686-694页

核心收录：

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 0906[农学-兽医学] 09[农学] 

基　　金：国家自然基金(项目号:31972626),题目:蜜蜂残翅病毒(DWV)结构蛋白与宿主互作蛋白筛选及其在感染中的作用研究 辽宁省省自然科学基金指导计划(项目号:20170540346),题目:Rab9基因修饰的巨噬细胞抗肿瘤效应研究 

主　　题：蜜蜂残翼病毒(DWV) TaqMan-MGB探针 qRT-PCR方法 临床检测 

摘      要：蜜蜂残翅病毒(Deform wing virus,DWV)已成为世界上最著名、分布最广、研究最为深入的昆虫病原。虽然DWV以前存在于蜜蜂种群中,但一种新的媒介—外寄生螨Varroa破坏体的到来和全球传播,极大地促进了DWV的流行病学。为了建立快速、准确且能定量分析的蜜蜂残翅病毒,DWV检测方法,本研究参照GenBank中已登录的DWV高度保守的3C-RdRp基因区域,设计了1对特异性引物和带有羧基荧光素(Fast Auxiliary Memory,FAM)与淬灭基团(Eclipse)标记的TaqMan探针,并对反应条件进行优化,建立了检测DWV的TaqMan-MGB探针荧光定量RT-PCR检测方法(TaqMan qRT-PCR),同时对该检测方法的特异性、敏感性、重复性进行了试验,并对临床样品进行检测。结果显示:该方法最佳上下游引物和探针浓度分别为12.5μmol/L和10μmol/L,最佳退火温度为59℃;敏感性试验中,对DWV质粒标准品检测下限为2.58×10^(1)拷贝/μL;本方法特异性较好,对蜜蜂常见病毒—蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)、蜜蜂急性麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、囊状幼虫病毒(Sacbrood virus,SBV)、以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)和中蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)无交叉反应;且批内变异系数和批间变异系数均小于2%。利用该方法对49份临床疑似样本进行检测,其中DWV阳性样本为35份,检出率高于常规RTPCR方法,且病毒载量大于1×10^(7)拷贝/只样本数共24份,表明辽宁和河北部分地区感染DWV蜂群中病毒载量较高,流行情况比较严重。因此,本研究建立的TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,能够用于DWV病原监测、流行病学调查和病毒定量分析等相关研究。