Mst-1调控缺氧复氧诱导的小鼠心肌细胞自噬及凋亡的机制

作     者：王艳 赵然尊 仇治梅 沈长银 陈攀科 郝星 袁近松 邓文文 石蓓 Wang Yan;Zhao Ranzun;Qiu Zhimei;Shen Changyin;Chen Panke;Hao Xing;Yuan Jinsong;Deng Wenwen;Shi Bei

作者机构：遵义医科大学附属医院心血管内科563000 遵义医科大学第二附属医院心血管内科563000 

出 版 物：《中华心血管病杂志》 (Chinese Journal of Cardiology)

年 卷 期：2020年第48卷第12期

页      面：1060-1069页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81860061) 贵州省科学技术基金[黔科合LH字(2014)7576号] 遵义市科技支撑项目[遵义合字(2016)06号] 遵义医科大学附属医院硕士科研启动基金[院字(2016)51号]。 

主　　题：肌细胞,心脏 哺乳动物不育系20样激酶1 自噬 凋亡 髓细胞生长因子1 

摘      要：目的探索小鼠心肌细胞中哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,Mst-1)调控缺氧复氧(hypoxia reoxygenation,HR)诱导的心肌细胞自噬及凋亡机制。方法采用酶消化法结合差速贴壁的方法培养小鼠乳鼠心肌细胞,通过缺氧24 h复氧6 h的方法建立HR模型。实验分组:对照组:正常培养的心肌细胞;Mst-1空病毒组:用重组慢病毒空载体转染心肌细胞48 h;Mst-1敲低组:用携带Mst-1小干扰RNA(siRNA)的重组慢病毒转染心肌细胞48 h;Mst-1过表达组:用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞48 h;HR组:建立心肌细胞HR模型;Mst-1敲低+HR组:用携带Mst-1 siRNA的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型;Mst-1过表达+HR组:用携带Mst-1基因的重组慢病毒转染心肌细胞后48 h建立心肌细胞HR模型。采用实时荧光定量RCR(qPCR)以及Western blot检测细胞中Mst-1 mRNA及蛋白相对表达量,免疫荧光染色检测心肌细胞标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT),及细胞自噬体与自噬溶酶体变化,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡水平,Western blot检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/LC3Ⅰ,P62及凋亡相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸酶剪切体(cleaved-caspase)9、半胱氨酸天冬氨酸酶前体(pro-caspase)9、cleaved-caspase-3、pro-caspase-3,以及髓细胞白血病1基因(MCL-1)的表达情况达。予以MCL-1抑制剂A1210477做回复实验,验证Mst-1通过调控MCL-1参与心肌细胞凋亡及自噬。结果免疫荧光检测发现培养细胞表达心肌细胞特异性标志物cTnT;HR情况下心肌细胞中Mst-1表达增加,慢病毒转染可有效抑制或过表达细胞中Mst-1。HR组与Mst-1过表达+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量低于对照组,而Mst-1敲低+HR组心肌细胞内自噬体及自噬溶酶体含量高于HR组(P均0.05)。TUNEL结果显示,HR组及Mst-1过表达+HR组中TUNEL阳性细胞比例高于对照组,而Mst-1敲低组+HR组中TUNEL阳性细胞比例低于HR组(P均0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,HR组及Mst-1过表达+HR组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值较低,P62与cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较高(P均0.05);与HR组比较,Mst-1敲低+HR组中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值较高,P62与cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3表达水平较低(P均0.05)。HR与Mst-1过表达+HR组心肌细胞中磷酸化(P)MCL-1蛋白表达水平低于对照组,Mst-1敲低+HR组的P-MCL-1蛋白表达水平高于HR组(P均0.05)。回复实验显示抑制细胞中MCL-1可阻断Mst-1 siRNA对细胞自噬及凋亡的调节作用。结论抑制心肌细胞中Mst-1的表达,可促进HR诱导的心肌细胞自噬,改善心肌细胞凋亡,该作用可能与其调控MCL-1表达相关。