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目的:研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染导致的肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的表达水平及各区间位点的变异,探讨HBV ccc DNA不同区域核苷酸位点突变与HC... 详细信息

目的:研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染导致的肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)的表达水平及各区间位点的变异,探讨HBV ccc DNA不同区域核苷酸位点突变与HCC疾病的关系。基于基因表达谱数据筛选HBV感染的HCC疾病关键基因因子,为基因靶向性预防和治疗肝癌提供参考因子。方法:收集49例重庆医科大学附属第一和第二医院HBV感染形成的HCC患者的血清及肝脏癌组织和配对的癌旁组织,首先检测患者临床病毒学指标,再用特异性荧光定量Tag Man探针方法检测肝组织内HBV ccc DNA和DNA在HCC癌组织及癌旁组织中的表达水平;然后利用滚环扩增(Roling circle amplification,RCA)技术特异性扩增癌组织及癌旁组织中肝脏内的cccDNA。进一步分析患者癌组织和癌旁组织HBV cccDNA和DNA表达水平的差异及ccc DNA在X区和前C/C区核苷酸突变位点及突变组合与HCC发生的关系;下载Gene Expression Ominibus(GEO)数据库中5对HBV感染的HCC配对样本基因表达谱数据,通过生物信息学分析方法筛选与HCC直接关联的关键候选因子。结果:(1)在49对hcc病人中,共有35例配对的癌组织和癌旁组织的cccdna有效检测,cccdna在癌组织中总体表达水平显著低于对应的癌组织(5.20vs.9.35copiesy/cell,p=0.0033);配对的癌组织和癌旁组织的cccdna经过rca扩增后,在x和prec/c区分别有18对和16对能有效扩增,cccdnax区域位点突变率在癌组织中显著高于癌旁组织(28.63%和20.94%,p=0.0313);序列比对后发现x区t1721g位点和prec/c区域a1979g的突变在hcc癌组织中发生的个数显著地高于癌旁组织(p=0.04075,or=10.1598;p=0.0155,or=13.7529);由t1727g突变形成的组合突变a1703g/t1727g、a1762t/g1764a/t1727g、a1703g/t1727g/a1762t/g1764a,a1979g突变形成的组合突变a1979g/a2189、a1979g/a2189c/t/c2288a、a1979g/a2189c/t/c2288a/a2075t在癌组织中发生的次数高于癌旁组织。(2)筛选得到的高风险肝癌模块中(75%)过量表达基因egr1,fos,dusp1,且共同参与mapk信号通路和下游通路细胞周期调控。结论:既往文献报道的hcc中的典型突变位点a1762t/g1764a、g1896a/g1899a等在本研究的样本中cccdna的x区间和prec/c区间在癌组织和癌旁组织中均有突变,且无明显差别;发现的t1721g和a1979g单核苷酸突变及组合位点突变更具有特征性,它们的突变可能与hbv感染的hcc疾病的发展关联密切。筛选得到的egr1,fos,dusp1基因很可能成为早期识别hcc的生物标志,同时也为基因靶向性治疗HCC提供了候选因子。

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SIRT3在肝细胞癌中的作用及机制研究

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作者：宋春丽重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：探讨沉默信息调节因子3（SIRT3）对肝癌细胞恶性增殖的影响及机制研究。方法：1.用western blot和qRT-PCR检测SIRT3在40例肝癌组织和癌旁组织中的表达水平，western blot检测SIRT3在8种肝癌细胞、两种永生化肝细胞和三个正常肝组... 详细信息

目的：探讨沉默信息调节因子3（SIRT3）对肝癌细胞恶性增殖的影响及机制研究。方法：1.用western blot和qRT-PCR检测SIRT3在40例肝癌组织和癌旁组织中的表达水平，western blot检测SIRT3在8种肝癌细胞、两种永生化肝细胞和三个正常肝组织中的蛋白表达水平。2.在肝癌细胞中瞬时过表达SIRT3后，通过台盼蓝排斥实验分析过表达SIRT3对肝癌细胞增殖的影响，Brdu标记实验检测肝癌DNA合成情况，软琼脂形成实验检测肝癌细胞不依赖支持物生长的能力，平板集落形成实验检测SIRT3对肝癌细胞集落形成能力的影响，流式细胞术检测过表达SIRT3对肝癌细胞周期的影响及对肝癌细胞凋亡的影响，western blot检测SIRT3对肝癌细胞凋亡过程中产生的PARP裂解片段的影响。3.通过siRNA干扰技术靶向沉默永生化肝细胞L02中SIRT3的表达，并通过western blot验证SIRT3基因的沉默效果，通过台盼蓝排斥实验分析SIRT3基因沉默对肝癌细胞生长的影响，EdU标记实验检测肝癌DNA合成情况，流式细胞术检测SIRT3基因沉默对肝癌细胞凋亡的影响。4.通过qRT-PCR筛选SIRT3过表达引起线粒体内凋亡相关基因的mRNA水平变化，并用western blot检测筛选出来的凋亡相关基因蛋白的变化情况。5.在裸鼠异种移植瘤模型中验证SIRT3对肿瘤生长的影响。结果1. SIRT3在肝癌组织中的蛋白水平和mRNA水平较正常肝组织显著降低，同时SIRT3在肝癌细胞中的蛋白水平较永生化肝细胞、正常肝组织降低。2.过表达SIRT3抑制肝癌细胞的增殖，抑制肝癌细胞DNA合成、肝癌细胞不依赖支持物生长的能力，及肝癌细胞的集落形成能力。SIRT3能显著诱导肝癌细胞G2期细胞周期阻滞。过表达SIRT3使肝癌细胞中凋亡细胞数显著增加，并伴随凋亡PARP裂解片段蛋白表达增加。3. SIRT3基因沉默可促进永生化肝细胞L02的生长和细胞DNA的合成。在表阿霉素的作用下SIRT3基因沉默可显著抑制L02凋亡。4. SIRT3过表达使肝癌细胞线粒体凋亡相关蛋白Bax明显升高，而且SIRT3过表达使Bax从胞浆转位到线粒体增多，Bax基因沉默可逆转SIRT3过表达引起的凋亡。5. SIRT3过表达抑制了肝癌的生长在裸鼠异种移植瘤中得到了验证。结论SIRT3可通过Bax信号通路诱导肝癌细胞凋亡。

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硫酸类肝素-3-0-磺基转移酶B1（HS3ST3B1）对乙型肝炎病毒（HBV）复制的下调作用

硫酸类肝素-3-0-磺基转移酶B1（HS3ST3B1）对乙型肝炎病毒（HBV）...

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作者：苏怀彬重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:在HBV的生命周期中,HBV的复制是受到宿主和自身各种因素控制的。本课题旨在研究宿主因子HS3ST3B1对HBV复制的影响,并探讨可能的作用机制。方法:将HS3ST3B1与HBV表达质粒pCH9-HBV共转染HepG2细胞,利用Southern blot和实时聚合... 详细信息

目的:在HBV的生命周期中,HBV的复制是受到宿主和自身各种因素控制的。本课题旨在研究宿主因子HS3ST3B1对HBV复制的影响,并探讨可能的作用机制。方法:将HS3ST3B1与HBV表达质粒pCH9-HBV共转染HepG2细胞,利用Southern blot和实时聚合酶链式反应（Real-time PCR ）技术检测过表达HS3ST3B1后HBV复制水平和总RNA水平的变化;同时,干扰过表达HS3ST3B1后,检测HBV复制水平和总RNA水平的变化;干扰内源性HS3ST3B1后,检测HBV复制水平的变化。在HBV稳定细胞株HepG2.H7中转染不同量HS3ST3B1,检测HBV复制水平的变化;利用双荧光素酶报告系统检测过表达HS3ST3B1后HBV启动子活性的改变,及干扰过表达的HS3ST3B1后HBV启动子活性的改变。结果:Southern blot显示:在HBV瞬时表达模型中,过表达HS3ST3B1后,HBV DNA水平有明显下降。RNAi干扰过表达HS3ST3B1后,HBV DNA水平则有所恢复;干扰内源性HS3ST3B1,HBV DNA水平有一定程度上升;在HBV稳定表达模型H7中,不仅进一步证实HS3ST3B1对HBV复制的下调作用,而且HBV DNA水平随着HS3ST3B1转染量增加而下降,呈现出HS3ST3B1的浓度依赖性。Real-time PCR显示:过表达HS3ST3B1后,HBV总RNA水平有明显下调,而干扰过表达HS3ST3B1后,HBV总RNA下调得到明显恢复;双荧光素酶报告系统结果显示:与过表达HS3ST3B1后,HBV四个启动子的活性均无明显差异,干扰过表达HS3ST3B1后,HBV四个启动子的活性亦无明显改变。结论:HS3ST3B1对HBV DNA和HBV总RNA都有下调,而HS3ST3B1对HBV总RNA水平的下调却不是HS3ST3B1抑制HBV启动子活性实现的。目的:建立特异性扩增cccDNA和rcDNA正链冗余序列区的方法及构建冗余序列区突变的HBV1.1倍体,为HBV冗余序列去除部位的研究奠定基础。方法: 1.从HBV稳定表达株HepG2.H7的培养上清中提取rcDNA,并设计引物,建立特异性扩增rcDNA正链冗余序列区的方法;2.利用Hirt法从HBV稳定表达株HepG2.H7中提取cccDNA,设计引物,建立特异性扩增cccDNA冗余序列的方法;3.设计针对HBV冗余序列区的突变引物,利用定点突变技术构建突变HBV1.1倍体,从而使得rcDNA冗余序列区发生突变。结果:成功建立特异性扩增cccDNA和rcDNA正链冗余序列区的方法,并构建了冗余序列区突变的HBV1.1倍体,为构建突变HBV稳定表达株,确认冗余序列去除部位奠定了基础。

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抗CP4-EPSPS单克隆抗体的制备和生物学特性的研究

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作者：敬凌霞重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:随着各种各样转基因食品通过贸易大量进入国际市场,转基因食品的安全性受到人们日益关注,世界各国对转基因食品的安全性存在着较大的争议,欧盟、日本等地区已经制定了相关法规对转基因食品进行了严格的管理。以孟山都(Monsato)公... 详细信息

目的:随着各种各样转基因食品通过贸易大量进入国际市场,转基因食品的安全性受到人们日益关注,世界各国对转基因食品的安全性存在着较大的争议,欧盟、日本等地区已经制定了相关法规对转基因食品进行了严格的管理。以孟山都(Monsato)公司的专利基因-CP4 EPSPS基因使用最为广泛,目前已广泛用于玉米、大豆、棉花等农作物。CP4 EPSPS基因来源于土壤农杆菌株系(Agrobacteriumsp)CP4株系,CP4 EPSPS基因编码CP4 EPSP合成酶,该酶对除草剂草甘膦有高抗性。本研究拟通过制备抗CP4-EPSPS蛋白的单克隆抗体,对抗体生物学特性进行鉴定,为国产EPSPS胶体金试纸条的研究创造条件,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供的工具。方法:诱导表达含转基因大豆CP4-EPSPS基因的原核表达重组载体pQE30/CP4-EPSPS、pET32a(+)/CP4-EPSPS,并且采用了Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化CP4-EPSPS蛋白,以SDS-PAGE进行初步鉴定,并以胶体金试纸条鉴定其免疫活性。以重组蛋白CP4-EPSPS免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗CP4-EPSPS的McAb,采用间接ELISA方法和Western blot进行McAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定McAb的Ig亚类、效价及相对亲和力,并进行McAb抗原结合表位分析;并对杂交瘤细胞的染色体进行分析。结果:重组蛋白CP4-EPSPS主要以包涵体表达,上清表达量极低,但胶体金试纸条检测发现上清中CP4-EPSPS蛋白抗原活性强,复性包涵体中CP4-EPSPS蛋白的抗原性远低于上清中CP4-EPSPS蛋白的抗原性。采用扩大培养量、缩小超声破碎重悬体积的方法,从上清中纯化CP4-EPSPS蛋白获得成功。通过杂交瘤技术成功获得两株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞Ⅲ5A3,Ⅲ13A2。其抗体亚类均为IgG1;腹水效价分别为1:106和1:108;相对亲和力Ⅲ5A3在105以上,Ⅲ13A2在106以上。ELISA相加实验结果显示两株McAb识别相同或相近的抗原表位。Western bolt检测证明两株杂交瘤细胞所分泌的McAb特异性良好。结论:成功地制备出抗CP4-EPSPS的两株McAb,为建立快速特异检测转基因植物(GMO)的实验方法提供了有力的工具。

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乙型肝炎病毒PreS1单克隆抗体的制备及特性研究

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作者：慕生枝重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:乙型肝炎病毒(HBV)感染危害巨大,慢性乙肝至今仍缺乏有效的治疗手段和解决方案,HBV感染机制的研究进展相对滞后是严重影响新型治疗方法和药物研发的重要原因之一。PreS1在HBV感染过程中具有很重要的作用,对于研究意义重大,但目前... 详细信息

目的:乙型肝炎病毒(HBV)感染危害巨大,慢性乙肝至今仍缺乏有效的治疗手段和解决方案,HBV感染机制的研究进展相对滞后是严重影响新型治疗方法和药物研发的重要原因之一。PreS1在HBV感染过程中具有很重要的作用,对于研究意义重大,但目前缺乏其特异性单克隆抗体,影响了其功能的深入研究。本研究通过原核表达纯化PreS1蛋白,利用杂交瘤技术制备PreS1特异性单克隆抗体,为进一步研究奠定基础。方法:1.采用PCR法扩增含HindⅢ与XbaⅠ酶切位点的PreS1基因片段,原核表达载体pGST-MOLUC及PCR产物经双酶切后,用T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM109构建并筛选重组质粒。随后将重组质粒转入表达宿主菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。以谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶为填料进一步采用亲和层析纯化融合蛋白。2.用PreS1融合蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术,制备抗PreS1的单克隆抗体,用ELISA方法筛选分泌抗PreS1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用间接ELISA方法和Western-blot进行McAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定McAb的Ig亚类,检测McAb的效价及相对亲和力,并进行McAb结合表位分析。并对其染色体进行分析。结果:1.采用PCR方法扩增得到与预期大小一致的目的基因片段。重组质粒经双酶切鉴定及测序分析证实重组质粒克隆成功,命名为pGST–PreS1。转化表达宿主菌后成功诱导出分子量为37kD的GST -PreS1融合蛋白,与预期分子量相符,诱导表达融合蛋白约占总菌蛋白的10%左右。Western-blot检测表明诱导表达的融合蛋白能分别与抗GST的单抗和抗PreS1的单抗发生特异性结合。采用谷胱甘肽-Sepharose 4B凝胶纯化融合蛋白,纯化蛋白纯度约为90%左右。2.成功筛选出两株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞P1A1和P2B3,其抗体亚类分别为IgG2b , IgG3;将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的Balb/c小鼠腹腔中制备腹水型PreS1的单克隆抗体,酶联免疫吸附试验(ELISA)证明腹水效价可达10-7;Western-blot结果鉴定提示该单克隆抗体可以特异的结合PreS1。ELISA相加实验结果显示2株McAb识别不同的抗原表位。结论:综上所述,我们运用重组DNA技术与原核表达方法获得了PreS1融合蛋白,利用该蛋白成功制备了PreS1单克隆抗体,所得抗体具有生物学活性,其抗体亚类分别为IgG2b和IgG3。为我们进一步探讨乙型肝炎病毒PreS1的生物学功能及其在HBV感染中的作用奠定了坚实的基础。

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抗登革病毒E蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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作者：陶萍重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:登革病毒(Dengue virus,DV)感染致死率高,登革热在世界范围内发病率不断升高,而目前尚无有效疫苗和特效药物,因此登革病毒感染的快速诊断有重要意义。登革病毒包膜蛋白E蛋白是重要的抗原蛋白,与免疫保护密切相关。本研究通过原核... 详细信息

目的:登革病毒(Dengue virus,DV)感染致死率高,登革热在世界范围内发病率不断升高,而目前尚无有效疫苗和特效药物,因此登革病毒感染的快速诊断有重要意义。登革病毒包膜蛋白E蛋白是重要的抗原蛋白,与免疫保护密切相关。本研究通过原核表达纯化E蛋白,利用杂交瘤技术制备DV-E特异性单克隆抗体,为进一步制备胶体金试纸奠定基础。方法:1.采用PCR法扩增E基因片段,原核表达载体pET 32-a及PCR产物经双酶切后,用T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM109构建并筛选重组质粒。随后将重组质粒转入表达宿主BL21感受态细胞,经IPGT诱导表达,对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。以Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化重组蛋白。2.用重组E蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术,制备抗DV-E的单克隆抗体,用ELISA方法筛选分泌抗DV-E单克隆抗体的杂交瘤细胞株,采用间接ELISA方法和Western-blot进行McAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA方法鉴定McAb的Ig亚类,检测McAb的效价。结果:1.采用PCR方法扩增得到与预期大小一致的目的基因片段。重组质粒经PCR鉴定及测序分析证实重组质粒克隆成功,命名为pET 32-a-E。转化表达宿主菌后成功诱导出分子量为70kD的重组E蛋白,与预期分子量相符。Western-blot检测表明诱导表达的融合蛋白能与抗DV的血清发生特异性结合。采用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化得到重组蛋白。2.成功筛选出一株可分泌特异性McAb的杂交瘤细胞7C7,其抗体亚类为IgG1;将生长良好的杂交瘤细胞接种到预处理的Balb/c小鼠腹腔中制备腹水型DV-E的单克隆抗体,酶联免疫吸附试验(ELISA)证明腹水效价可达10-6;Western-blot鉴定结果提示该单克隆抗体可以特异结合DV-E。结论:综上所述,我们运用重组DNA技术与原核表达方法获得了重组E蛋白,利用该蛋白成功制备了抗DV-E单克隆抗体,所得抗体具有生物学活性,其抗体亚类为IgG1。为进一步制备快速检测登革病毒的胶体金试纸条奠定了坚实的基础。

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乙肝病毒核心抗原二聚体形成相关氨基酸序列鉴定

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作者：甘春杨重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:乙肝病毒核心颗粒的基本构成单位是核心蛋白(HBc)二聚体,与二聚体形成相关的核心蛋白一级结构尚未被充分鉴定,造成该现状的一个重要原因,是缺乏一种简便有效的表征HBc二聚体形成的方法,本研究的目的,是建立一种可用于反映HBc二聚... 详细信息

目的:乙肝病毒核心颗粒的基本构成单位是核心蛋白(HBc)二聚体,与二聚体形成相关的核心蛋白一级结构尚未被充分鉴定,造成该现状的一个重要原因,是缺乏一种简便有效的表征HBc二聚体形成的方法,本研究的目的,是建立一种可用于反映HBc二聚体形成的新方法,并用该方法来鉴定与乙肝病毒核心蛋白(HBc)二聚体形成相关的重要氨基酸序列。方法:我们首先构建了一种可反映乙肝病毒核心蛋白二聚体形成新方法,该方法主要基于分段的海肾荧光素酶(Rluc)互补原理。将Rluc基因分为N(1-229aa),C(229-311aa)两段,分别与核心蛋白基因通过长片段接头融合,当HBc二聚体形成时,这两段可通过互补部分恢复荧光素酶活性,因而该酶活性可以间接反映二聚体的形成情况。然后,我们构建一系列乙肝病毒核心蛋白缺失突变体,以鉴定对HBc二聚体形成较为重要的氨基酸序列。最后,在3x Flag-HBC系统上对某些缺失突变体是否能形成capsid进行了研究。结果:1.利用Golden gate克隆方法,成功构建了一系列质粒,包括过渡载体质粒GG1,质粒Rluc N-HBc,Rluc C-HBc,阴性对照质粒Rluc N-d HBc和Rluc C-d HBc,突变质粒Rluc N-HBc127Q,Rluc C-HBc127Q,Rluc N-HBc132A,Rluc C-HBc132A,Rluc N-HBc42A,Rluc C-HBc42A,Rluc N-HBc23A,Rluc C-HBc23A;2.转染实验表明,Rluc N-HBc与Rluc C-HBc共转染HEK293细胞后,与三种对照组Rluc C-d HBC+Rluc N-d HBC,Rluc C-HBC+Rluc N-d HBC,Rluc C-d HBC+Rluc N-HBC相比,Rluc C-HBC+Rluc N-HBC所产生的荧光素酶活性高出25倍以上;3.各种核衣壳形成缺陷型突变体,包括Rluc N-HBC127Q+Rluc C-HBC127Q,Rluc N-HBC132A+Rluc C-HBC132A,Rluc N-HBC23A+Rluc C-HBC23A,以及Rluc N-HBC42A+Rluc C-HBC42A共转染,产生的光信号与野生型Rluc N-HBC+Rluc C-HBC相比,均没有显著降低;4.成功构建了覆盖HBc N端,C端以及5个а螺旋区域的总共30余种缺失突变体质粒(基于质粒Rluc C-HBc);5.以上突变体质粒分别于Rluc N-HBC共转染后,Rluc荧光素酶活性检测结果显示,C端覆盖122-183aa、N端覆盖1-5aa的缺失突变保留阳性对照50-80%的荧光素酶活性;N端覆盖6-41aa、C端103-120aa的缺失突变体则接近阴性对照水平;覆盖6-17、30-41、75-81、86-90、121-143的缺失突变均获得阳性对照80%以上的荧光素酶活性,覆盖26-29、61-65、71-75、117-120的缺失突变约为阳性对照的40%左右,而覆盖18-25、50-60、66-70、81-85、91-116的缺失突变为阳性对照的20%一下。6.3x Flag-HBCd81-85、d86-90能形成capsid,3x Flag-HBCd38-41d50-55、d91-95、d106-110不能形成capsid。结论:1.成功构建能反映乙肝病毒核心蛋白二聚体形成的分段海肾荧光素酶报告系统;2.序列50-55、91-95、106-110对乙肝病毒核心蛋白二聚体的形成是必须的;3.序列18-25、56-60、66-70、96-105、111-116对乙肝病毒核心蛋白二聚体的形成可能是重要的。

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SCAP超表达对细胞脂代谢的影响及其相关可能机制研究

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作者：王媛媛重庆医科大学

学位级别：硕士

细胞内胆固醇主要来源有两种途径,包括外源性胆固醇摄入和内源性胆固醇合成,它们均通过一个依赖于细胞内胆固醇水平的反馈调节系统的严密控制来保证胆固醇的内稳态平衡,即主要通过SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA reductase通路实现对细胞内脂... 详细信息

细胞内胆固醇主要来源有两种途径,包括外源性胆固醇摄入和内源性胆固醇合成,它们均通过一个依赖于细胞内胆固醇水平的反馈调节系统的严密控制来保证胆固醇的内稳态平衡,即主要通过SCAP-SREBP2-LDLr/HMGCoA reductase通路实现对细胞内脂质稳态平衡的调节。SREBP2是一个绑定在内质网膜和核膜的含三区域的蛋白。SREBP2的NH2-末端是一个转录因子,它与一个多基因编码酶的启动子区域内的胆固醇调节元件相结合,而这一多基因编码酶在胆固醇合成和胆固醇摄取中起着决定作用。SREBPs的NH2-末端区域的蛋白水解是相继进行的,蛋白酶裂解SREBPs是由SREBP裂解激活蛋白(SCAP)所激活的。SCAP-SREBP复合物在细胞内胆固醇下降时会产生。SCAP有一个胆固醇敏感区域,在细胞内胆固醇水平增加的时候,能抑制复合物的形成,从而形成一个负反馈环。目的为建立平滑肌特异的固醇调节元件结合蛋白(SREBP)的裂解激活蛋白(SCAP)超表达转基因小鼠,深入探讨SCAP的功能,本实验构建了由平滑肌特异蛋白SM22启动子(pSM22)启动仓鼠SCAP 443位点突变体——SCAP(D443N)的真核表达质粒,并在仓鼠卵巢细胞(CHO)、肾系膜细胞(HMCL)、血管平滑肌细胞(VSMCs)上验证其表达及功能。方法1.利用巢式PCR从小鼠肝脏组织提取的基因组中扩增得到pSM22基因,利用PCR从pTK-HSV-SCAP(D443N)质粒中扩增出SCAP(D443N)后构建真核表达质粒pcDNA-SM22-SCAP(D443N)。2.采用两周龄胎鼠制备原代培养的VSMCs。3.转染pcDNA-SM22-SCAP(D443N)真核表达质粒分别至CHO细胞、HMCL细胞、VSMCs细胞,验证质粒的表达及功能。用酶学法分别检测细胞内总胆固醇(TC)水平;油红O染色观察细胞内脂质积聚情况;提取细胞总RNA,应用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative PCR)检测LDLr、SREBP2、SCAP、HMGCoA水平;用Western blotting法检测LDLr、SREBP2和SCAP、HMGCoA蛋白表达水平。结果1.成功构建了真核表达质粒pTK-HSV-SCAP(D443N)。2.原代VSMCs制备成功。***过表达能够增加细胞SREBP2、LDLr及HMGCoA的mRNA的表达及蛋白表达。即使在高浓度胆固醇水平下,上述基因的合成仍然增加。通过油红O和胆固醇测定发现SCAP过表达能增加细胞内的脂质积聚。这一现象打破了LDLr的生理性负反馈调节,进而促使了泡沫细胞的形成。

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