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作者：李小慧天津农学院

学位级别：硕士

鸡慢性呼吸道疾病(Chronic Respiratory Dsiease,CRD)是由鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum,MG)感染引起的慢性、接触性呼吸道疾病。CRD以慢性呼吸道症状,机体免疫力降低,易引起继发感染为主要特征,可引起鸡群生产性能降低,胴体废弃... 详细信息

鸡慢性呼吸道疾病(Chronic Respiratory Dsiease,CRD)是由鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum,MG)感染引起的慢性、接触性呼吸道疾病。CRD以慢性呼吸道症状,机体免疫力降低,易引起继发感染为主要特征,可引起鸡群生产性能降低,胴体废弃,常给国内外养鸡业造成了十分严重的经济损失。TM-1蛋白是一种溶血素膜蛋白,与MG粘附宿主细胞相关,是诱导机体产生保护性免疫的主要抗原之一,保守性高,变异率低。鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的鸡的一种急性上呼吸道传染病,该病可导致鸡只死亡,产蛋量减少,呈世界性地分布,已成为危害养禽业的重要疫病之一。gD糖蛋白是ILTV复制和诱导宿主产生免疫应答反应的主要保护性抗原。本试验通过质粒PCR、双酶切及测序鉴定后,将含有TM-1和gD基因的pMD-TM-1和pMD-gD进行双酶切,经T4酶连接于克隆载体pDC315-EGFP上,PCR、酶切及测序鉴定后分别获得穿梭载体pDC315-TM-1、pDC315-gD和pDC315-TM-1-gD;利用LipoFiterTM脂质体转染法将重组穿梭载体与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3cre共转染HEK293细胞,在真核细胞中实现同源重组,经荧光显微观察、RT-PCR和Western blotting检测,包装出能表达TM-1蛋白、gD蛋白和TM-1-gD融合蛋白的重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD和pBH-TM-1-gD;P4代重组腺病毒感染48 h后,提取HEK293细胞总RNA,RT-PCR法检测TM-1和gD基因的表达,同时提取细胞总蛋白,经Western blotting检测TM-1蛋白、gD蛋白及TM-1-gD融合蛋白的表达量;使用Vivapure AdenoPACKTM法纯化病毒粒子,以TCID50法确定重组腺病毒pBH-EGFP、pBH-TM-1、pBH-gD和pBH-TM-1-gD的滴度分别为109.5TCID50/mL、109.625TCID50/mL、109.25TCID50/mL和1010.125TCID50/m L,符合后续动物试验所需滴度要求;肌肉注射免疫SFP雏鸡,间隔7d加强免疫1次,免疫鸡只未出现呼吸道症状,且免疫鸡体重无明显降低(p>0.05);于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d采血,间接ELISA结果显示重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-g D免疫效果与疫苗组无显著差异(p>0.05),双基因pBH-TM-1-gD诱导MG抗体水平则极显著低于常规疫苗组(p0.05);脾脏指数分析结果显示:与对照组合pBH-EGFP相比较,重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD和疫苗组均显著升高(p<0.05),但重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD和疫苗组均无显著性。本研究首次将MG的TM-1基因和ILTV的gD基因融合重组,并成功构建可用于真核系统表达的重组腺病毒pBH-TM-1-gD,在与常规疫苗对比的基础上探讨其免疫效果,为研制鸡毒支原体病和鸡传染性喉气管炎两种禽类接触性呼吸道传染病二联基因工程活载体疫苗提供参考,同时也为新型禽类呼吸道疫苗提供理论基础。

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鸡传染性法氏囊病毒新型变异株亚单位疫苗的研制与免疫效力评价

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作者：郑玉闯天津农学院

学位级别：硕士

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BVDV多表位疫苗的构建及免疫效果评价

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作者：赵微天津农学院

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是一种与世界范围内牛的胃肠道、呼吸道和生殖系统疾病相关的重要病原体。这种疾病传播的范围和缺乏性治疗,使其成为全球地方性流行病和最重要的牛疾病之一,对全世界许多国家的畜牧... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)是一种与世界范围内牛的胃肠道、呼吸道和生殖系统疾病相关的重要病原体。这种疾病传播的范围和缺乏性治疗,使其成为全球地方性流行病和最重要的牛疾病之一,对全世界许多国家的畜牧业和乳制品行业均造成了巨大的经济损失。本研究的目的是筛选具有较高的免疫原性肽段,使肽段与E0和E2基因经T2A剪切肽连接,构建共表达载体,使其各自发挥免疫功效,实现多基因的协同免疫效应,实现对BVDV的免疫保护作用,籍此为BVD疫苗研究提供新的研究思路和方法。本研究通过在线生物软件对BVDV的C、E0、E2、NS3基因进行TH细胞表位、CTL细胞表位及B细胞表位筛选;对筛选获得的优势抗原表位序列,选择柔性短肽GGGGS连接和选择刚性短肽GPLS连接,连接肽段(命名为AKK),通过生物学在线软件对其进行分析;将AKK-E0-E2、AKK、E0、E2基因序列重组到真核表达载体GV658中,用双酶切法检测靶基因的大小;将新构建的4种重组质粒转染MDBK细胞,CCK-8实验评估其安全性;RT-PCR和western blotting验证目的基因蛋白的表达情况。试验结果表明,AKK肽段具有较好的免疫原性,所构建的重组质粒GV658-AKK-E0-E2、GV658-AKK、GV658-E0、GV658-E2双酶切结果显示,明亮条带与目的基因大小相符,转染MDBK细胞也获得相应蛋白的成功表达,且对MDBK细胞无明显损伤作用。将SD大鼠随机分为4组试验组,1组PBS组,每组6只。用所构建的质粒DNA疫苗,免疫SD大鼠。最后一次免疫结束2周后,称重采血解剖分析。流式细胞术结果显示,GV658-AKK-E0-E2组CD4+/CD8+比值为1.71,PBS组CD4+/CD8+比值为1.11,差异极显著(P0.05),各实质脏器组织切片均无明显病理变化。ELISA检测结果显示,AKK-E0-E2、AKK、E0、E2和PBS组抗体滴度分别为152.58μg/m L、133.13μg/m L、131.32μg/m L、127.22μg/m L、117.21μg/m L。AKK-E0-E2极显著高于PBS组(P<0.01),其中,AKK、E2显著高于PBS组(P<0.05),AKK-E0-E2组高于E0组(P<0.05)。综上所述,本课题构建的重组BVDV多表位疫苗,各组疫苗免疫之后均可诱发免疫反应,发挥细胞与体液免疫效应。并且对大鼠未造成明显的损伤,安全性较好,为牛病毒性腹泻-黏膜病的预防提供参考。

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牛Ag85B、MPT63、HSP65与表位基因重组减毒沙门菌的构建及免疫效果评价

牛Ag85B、MPT63、HSP65与表位基因重组减毒沙门菌的构建及免疫效...

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作者：任君天津农学院

学位级别：硕士

牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病,每年全球约有5 000万头牛患病,此病对于许多国家来说都是一个棘手的问题,尤其是那些由于经济原因无法实施“检测-淘汰”政策的发展中国家,以及那些因为野生动物宿主活动导致家畜反... 详细信息

牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病,每年全球约有5 000万头牛患病,此病对于许多国家来说都是一个棘手的问题,尤其是那些由于经济原因无法实施“检测-淘汰”政策的发展中国家,以及那些因为野生动物宿主活动导致家畜反复感染的国家。为解决这些问题,人们提出替代控制措施的方法—疫苗接种。牛结核分枝杆菌具有多种特异性抗原,其中,Ag85复合物可诱导Th1型免疫应答,在调控牛结核分枝杆菌胞内感染过程中具有重要作用;MPT63是牛结核分枝杆菌分泌的与毒力相关的小分子质量蛋白;HSP65是牛分枝杆菌中免疫应答的主要靶点,也是结核分枝杆菌黏附巨噬细胞的关键成分。多表位疫苗又称为鸡尾酒式疫苗,可同时携带多个目标抗原的辅助性表位。与传统疫苗相比,多表位疫苗可被多种MHC分子识别,抗原呈递更加高效,同时还具有独特的细胞免疫优势,其免疫作用不受病原微生物变异的影响。进一步研究发现,将沙门菌在基因水平上进行基因缺失减毒处理后,减毒的沙门菌虽毒力减弱但其对细胞的侵袭力依旧完整,因此,非常适宜作为疫苗载体。本研究选取牛结核病三种特异性抗原基因Ag85B、MPT63和HSP65,首先利用生物在线软件IEBD和Bepi Pred分析其B细胞表位和T细胞表位,然后对筛选出表位肽段进行连接,将构建的新表位基因命名为AMH,利用Vaxi Jen、Expay、Sopma和MODEL这些软件对表位序列AMH进行免疫原性、理化性质、二级结构和三级结构分析。构建的表位基因AMH和牛结核病的三种特异性抗原基因利用T2A或者P2A连接并构建至真核表达载体p EGFP,最后对重组质粒进行双酶切和PCR鉴定。将鉴定正确的重组质粒p EGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65转染至HEK293细胞,检测重组质粒在细胞内的转染情况,通过反转录和Western Blot试验验证重组质粒在细胞水平上的表达情况。试验结果表明构建的表位蛋白AMH具有良好的免疫原性、亲水性和稳定性;构建的重组质粒在细胞中有良好的转染效率,且目的基因能在细胞内顺利反转录成RNA,目的蛋白也均有表达。将重组表达载体p EGFP-AMH-Ag85B-MPT63-HSP65通过热激的方式转入减毒沙门菌中,经过PCR和测序验证构建成功后,对重组减毒沙门菌分别进行体外和体内相关试验。体外试验中,对重组减毒沙门菌进行生长曲线、体外稳定性和侵染细胞试验。体内试验中,用重组减毒沙门菌口服免疫小鼠,检测重组减毒沙门菌在小鼠体内的免疫效果;通过采集不同时间段的小鼠血清,检测血清中相关抗体及细胞因子水平的变化;二免14天后处死小鼠,解剖并摘取相关脏器计算脏体比,提取脾淋巴细胞进行分型实验,取相关脏器做病理切片HE染色。体外试验结果表明,外源基因的导入对减毒沙门菌的生长无明显影响,且重组减毒沙门菌在含Kan抗性的环境中可稳定携带外源基因,重组减毒沙门菌在细胞水平上可稳定传递外源基因传递出来。体内试验结果表明,重组减毒沙门菌免疫小鼠后可刺激小鼠产生Ig G和s Ig G,刺激细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10的生成,并提高CD3、CD4、CD8的占比,且口服重组减毒沙门菌对小鼠生长无明显影响。综上所述,本研究通过激发表位基因启动自身的细胞和体液免疫功能,利用牛结核病三种特异性抗原基因Ag85B、MPT63和HSP65启动特异性免疫反应。实现了多基因协同的免疫效应,试验结果证明利用表位蛋白所构建的重组减毒沙门菌安全性较高且具有良好的免疫效果,为牛结核病的基因疫苗研究提供试验基础和理论支持。

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NDV HN基因和ILTV gD基因重组腺病毒的构建及免疫效果评价

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作者：高珂珂天津农学院

学位级别：硕士

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性传染性疾病,在全世界范围内流行传播,属于严重危害养鸡业的疫病之一。血凝素-神经氨酸酶(H-N)蛋白具有良好的免疫原性,已成为目前... 详细信息

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一种急性、高度接触性传染性疾病,在全世界范围内流行传播,属于严重危害养鸡业的疫病之一。血凝素-神经氨酸酶(H-N)蛋白具有良好的免疫原性,已成为目前研究新城疫基因工程疫苗的首选目的基因之一。鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)引起的一种传染病。gD糖蛋白是ILTV复制和诱导宿主产生免疫应答反应中的主要保护性抗原,该蛋白编码基因高度保守,为ILTV吸附和侵染所必须的,可以诱导机体产生体液和细胞免疫应答,由其引起的细胞免疫应答效应高于gB和gC基因。目前,市面上应用较多是NDV和ILTV弱毒疫苗,弱毒疫苗有返毒返强等缺点,而基因工程疫苗安全性高,还可构建多价疫苗和多联苗,在新型疫苗研究中有开阔的前景。***和gD基因重组腺病毒的构建与鉴定试验通过RT-PCR/PCR方法扩增得到HN和gD基因;将目的基因通过T-A克隆至pMD19-T载体上,获得质粒pMD-HN和pMD-gD;经酶切及测序鉴定后与穿梭载体pDC-EGFP连接,分别获得重组腺病毒穿梭质粒pDC-HN-EGFP、pDC-gD-EGFP和pDC-HN-gD-EGFP;将重组腺病毒穿梭质粒与腺病毒大骨架共转染至HEK293细胞;经RT-PCR检测,构建的重组腺病毒可以感染HEK293细胞;Western blotting检测HN蛋白和gD蛋白在HE293细胞中高表达;扩增纯化后的重组腺病毒经半数组织感染剂量法(TICD)测定其病毒滴度,结果显示构建的重组腺病毒pBH-HN-EGFP、pBH-gD-EGFP、pBH-HN-gD-EGFP和pBH-EGFP的滴度分别为10TCID/mL、107.875TCID/mL、10 TCID/mL和1011.25 TCID/mL,符合后续动物试验所需的病毒滴度。***组,HN和gD基因重组腺病毒的免疫效果评价将PBS组、pBH-EGFP、NDV弱毒疫苗(Lasota)组、重组腺病毒pBH-HN-EGFP组和pBH-HN-gD-EGFP组进行免疫试验。鸡增重试验结果表明,重组腺病毒疫苗对SPF鸡的生长无明显抑制作用;免疫后抗体水平结果显示:NDV弱毒疫苗(Lasota)组与重组腺病毒pBH-HN-EGFP组和pBH-HN-gD-EGFP组差异不显著(p>0.05),均与PBS组和pBH-EGFP组差异显著(p0.05),均与PBS组和pBH-EGFP组差异显著(p<0.05);淋巴细胞检测结果表明:ILTV弱毒疫苗K317株组与重组腺病毒组均能诱导CD3、CD4、CD8和Bu-1a细胞增殖。说明该重组腺病毒可以诱导机体产生体液免疫和细胞免疫。综上所述,本研究成功构建了重组腺病毒pBH-HN-gD-EGFP活载体疫苗,且能使机体产生体液免疫和细胞免疫,可以作为ND和ILT的新型候选疫苗。

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猪传染性胸膜肺炎杆菌菌影装载猪源巴氏杆菌外膜蛋白H基因疫苗的免疫效果评价

猪传染性胸膜肺炎杆菌菌影装载猪源巴氏杆菌外膜蛋白H基因疫苗的...

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作者：徐良天津农学院

学位级别：硕士

由猪传染性胸膜肺炎杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起的猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）和多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocide）引起的猪萎缩性鼻炎（Porcine infectious atrophic rh... 详细信息

由猪传染性胸膜肺炎杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起的猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia，PCP）和多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocide）引起的猪萎缩性鼻炎（Porcine infectious atrophic rhinitic，AR）以及猪肺疫（Swine plague）是猪场常见的呼吸道传染病，常呈混合感染。感染病猪呼吸道结构被破坏，容易受到其他呼吸道病原菌的感染，常给世界养猪业带来巨大的经济损失。因此，有必要开发一种联合疫苗对上述猪病进行预防。本研究利用A型猪源多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H成功构建了pCDNA-ompH基因疫苗，并将其装载到猪胸膜肺炎杆菌菌影中，制备了胸膜肺炎杆菌菌影装载pCDNA-ompH基因的二联疫苗，再通过小鼠攻毒试验评估其免疫保护效果，为该疫苗的临床应用奠定了实验基础。试验中将小鼠分成四组，其中三组分别用App菌影、pCDNA-ompH基因疫苗、App菌影装载pCDNA-ompH基因二联疫苗进行免疫接种，最后一组作为对照。共进行三次免疫，每次间隔2周，免疫一周后断尾采血，利用间接ELISA法检测抗体效价;最后一次免疫后2周用最小致死量活菌攻毒，观察一周，对于攻毒期间死亡小鼠进行剖检，采集心、肝、脾、肺、肾进行病理组织分析;一周后统计活鼠数量，解剖并观察病理变化，取血样本用于抗体测定，取心、肝、脾、肺、肾脏器用于病理组织分析。试验结果显示：App攻毒开始后小鼠出现食欲下降、精神沉郁、被毛粗糙、呼吸困难等现象，攻毒后App菌影疫苗免疫组死亡1只、App菌影疫苗装载pCDNA-ompH基因疫苗免疫组无死亡、对照组全部死亡，App菌影和App菌影装载pCDNA-ompH基因二联疫苗对最小致死量App I型活菌攻毒的保护率分别为90%和100%;Pm攻毒组小鼠出现食欲下降、被毛凌乱、腹泻、呼吸困难、反应迟缓等现象，攻毒后pCDNA-ompH基因疫苗免疫组死亡3只，App菌影装载pCDNA-ompH基因二联疫苗免疫组无死亡，对照组全部死亡，pCDNA-ompH基因疫苗和App菌影装载pCDNA-ompH基因二联疫苗对最小致死量Pm D型活菌攻毒的保护率分别为70%和90%。血清型A型多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白H构建的基因疫苗，可以对血清型D型多杀性巴氏杆菌的攻毒产生交叉保护效力。病理切片分析可见App攻毒对照组的肺脏和肝脏淤血严重，肺部有凝固性坏死，菌影疫苗组和二联疫苗组存活小鼠则无明显病变或病变较轻;Pm攻毒对照组肾脏可见淤血、坏死、水泡变性，肺脏肺间质增宽和大面积淤血出血以及炎性细胞浸润等病变，攻毒存活的小鼠肾脏有轻微出血现象，肺部有轻微的淤血，其余各器官均正常。对比免疫前后和攻毒后小鼠，App菌影装载pCDNA-ompH二联疫苗组小鼠抗体滴度略高于App菌影组和pCDNA-ompH基因疫苗组，二联疫苗免疫的保护效果高于单一疫苗的免疫。本研究说明菌影装载基因疫苗构建二联疫苗的方法可行，已经取得的实验数据，可为进一步对猪传染性胸膜肺炎、猪萎缩性鼻炎以及猪肺疫的免疫保护奠定实验基础。

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传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ与多杀性巴氏杆菌OmpH二联基因疫苗的研究

传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ与多杀性巴氏杆菌OmpH二联基因疫苗...

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作者：姚景丽天津农学院

学位级别：硕士

由胸膜肺炎放线杆菌(App)引起的猪传染性胸膜肺炎和由多杀性巴氏杆菌(Pm)引起的猪萎缩性鼻炎及猪肺疫是常见的猪呼吸系统疾病,上述两种疾病常呈混合感染,各年龄段猪群均易感,可通过气溶胶及接触传播,常呈全群性爆发,给养猪业带来了极大... 详细信息

由胸膜肺炎放线杆菌(App)引起的猪传染性胸膜肺炎和由多杀性巴氏杆菌(Pm)引起的猪萎缩性鼻炎及猪肺疫是常见的猪呼吸系统疾病,上述两种疾病常呈混合感染,各年龄段猪群均易感,可通过气溶胶及接触传播,常呈全群性爆发,给养猪业带来了极大的损失。本研究利用传染性胸膜肺炎放线杆菌的外毒素蛋白ApxⅣ和多杀性巴氏杆菌的外膜蛋白H(OmpH)制备可以同时防控以上两种疾病的二联基因疫苗,为胸膜肺炎放线杆菌和多杀性巴氏杆菌疫苗的研究提供理论基础。本研究通过在线生物软件对APP的外毒素ApxⅣ与Pm的外膜蛋白H(OmpH)基因进行T细胞和B细胞表位筛选;将筛选的优势抗原表位序列通过连接肽连接后,构建新的肽段(命名为New),并利用在线生物信息软件对其进行分析;分别将ApxⅣ、OmpH和New基因序列通过同源重组的方法构建至真核表达载体GV658,通过双酶切验证目的基因的大小;将新构建的3种重组粒转染HEK293细胞,CCK-8实验评估其对细胞的安全性;RT-PCR和western blotting验证外源基因蛋白的转录和表达情况;免疫荧光(IFA)验证重组质粒中外源基因蛋白在细胞中的免疫定位。试验结果显示,New肽段具有较好的免疫源性,所构建的重组质粒GV658-ApxⅣ、GV658-OmpH、GV658-New双酶切结果与目的基因大小相符,可转染HEK293细胞并成功表达,且对HEK293细胞无明显损伤作用。将构建的3种重组质粒等比混合,制备APP与Pm二联基因疫苗,同时制备GV658-ApxⅣ、GV-658-OmpH、GV658-New 3 种质粒疫苗及 APP 菌影疫苗,PBS 为对照组,每2周对SD大鼠进行免疫,连续免疫3次。最后一次免疫结束后2周采取外周血并解剖摘取内脏进行分析。流式细胞术结果显示,二联疫苗组(Mix)CD3+细胞、CD4+/CD8+细胞比例升高,显著高于PBS组(P0.05);脏器病理组织切片和脏器体重比结果显示,各组实验组与对照组一样,组织切片与脏器体重比结果均正常;肝脏组织切片免疫荧光(IFA)结果显示,除对照组外各实验组在肝脏组织中均可见明显的荧光染色。综上所述,本课题构建的重组二联基因疫苗,产生的抗体滴度与APP菌影、ApxⅣ、OmpH、New单苗结果一致并对动物机体未造成明显的损伤,安全性较好,可同时对APP和Pm 2种疾病产生免疫保护。籍此,为APP与Pm疫苗的研究提供理论依据和研究基础。

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mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠黑色素瘤细胞的作用研究

mTERT和mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒的构建及其对小鼠...

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作者：龙雨清天津农学院

学位级别：硕士

黑色素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤,占恶性肿瘤的1%%,恶性程度高,转移早且发生广泛,对传统的治疗方法有较强的抗性,是临床治疗上一种颇为棘手的恶性肿瘤。由于黑色素瘤常发生在皮肤,易于观察,因此非常适用于基因治疗的研究。随着分子生... 详细信息

黑色素瘤是一种常见的皮肤恶性肿瘤,占恶性肿瘤的1%%,恶性程度高,转移早且发生广泛,对传统的治疗方法有较强的抗性,是临床治疗上一种颇为棘手的恶性肿瘤。由于黑色素瘤常发生在皮肤,易于观察,因此非常适用于基因治疗的研究。随着分子生物学、基因组学、免疫学、病理学以及相关学科的快速发展,以基因治疗为主线的治疗方法逐渐成为肿瘤学的研究热点。目前,腺病毒(Adenovirus,Ad)载体疗法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一,它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中,载体的构建和操作简单,宿主范围广,感染性强,可经不同途径进入不同组织,还能感染分化后的非分裂期细胞。本研究选择新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)的血凝素-神经氨酸酶(hemagglutinin neuraminidase,HN)基因作为黑色素瘤的治疗基因。大量研究结果表明,HN蛋白是NDV发挥抗肿瘤作用的主要成分,HN蛋白不仅具有介导病毒吸附于肿瘤细胞并与融合蛋白一起辅助病毒侵入肿瘤细胞的作用,还具有神经氨酸酶活性,能水解宿主细胞表面的唾液酸,暴露宿主细胞的生物识别位点,促进抗原递呈,引起肿瘤周围的细胞因子和化学因子生成增加,引发淋巴细胞、单核细胞浸润等。为了强化HN基因对黑色素瘤的治疗效果,研究中利用端粒酶启动子和酪氨酸酶双启动子来调控治疗基因HN的表达。端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)是负责端粒酶催化活性最重要的组分。端粒酶活性的变化与细胞的衰老和肿瘤的发生息息相关。TERT表达于90%以上的肿瘤,大多数人类和小鼠的癌症或肿瘤衍生的细胞系中都有端粒酶活性的高表达,因而是广谱的肿瘤标志物。酪氨酸酶(Tyrosinase,Tyr)是黑色素瘤形成过程中的一种关键酶,其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量,该酶活性过高会导致色斑及黑色素瘤的形成。大量研究发现Tyr启动子只在黑色素瘤细胞中特异性表达,而在其他组织中不表达。因此,TERT和Tyr具有调控下游治疗基因HN的特性。本研究根据Gen Bank中mTERT基因序列(AF157502.1)、mTyr基因序列(D00439.1)和NDV HN cDNA序列(EF211815.1),设计一对PCR扩增引物和两对RT-PCR扩增引物,分别从C57BL/6小鼠的胸腺DNA、小鼠黑色素瘤B16细胞总RNA和pShuttle-CMV-HN质粒中扩增出目的片段;将目的片段分别连接于pMD-19T载体,命名为pMD-mTERTp、pMD-mTyrp、pMD-HN;经酶切及测序鉴定后,分别对上述载体和pShuttle-IRES-hrGFP-2进行双酶切,用T4酶连接并构建重组穿梭载体;线性化重组穿梭载体与骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,经鉴定正确后,将重组腺病毒质粒经脂质体转染HEK293细胞,包装出能表达HN基因的由双启动子调控的特异性重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN;经RT-PCR、Western blotting鉴定及测序分析后,经CsCl密度梯度超速离心法大量纯化病毒颗粒,以TCID方法测定重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-Tyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和Ad-GFP的最终滴度分别为10TCID/mL、102.52.5 TCID/mL、10 TCID/m L、10 TCID/m L和10 TCID/mL,符合后续的抑瘤实验所需病毒要求;通过Hochest33342/PI染色实验证实构建的重组腺病毒能够感染B16细胞;MTT试验结果表明Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16细胞生长的抑制作用在第4d达到最大值,且抑制率显著大于其他对照组重组腺病毒,Western blotting检测到HN蛋白在B16细胞中的表达,经流式细胞仪检测重组腺病毒Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和对照腺病毒Ad-GFP对B16细胞的凋亡率分别为28.03±0.45%、48.36±0.95%、39.12±0.78%、58.39±1.47%、19.05±0.89%。本研究的创新之处在于,首次结合端粒酶逆转录酶启动子与酪氨酸酶启动子的肿瘤特异性和组织特异性、HN基因的细胞凋亡作用以及腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性,成功构建出融合表达上述基因的Ad-mTERTp-Tyrp-HN,为下一步利用重组腺病毒在体外诱导肿瘤细胞凋亡及研制动物肿瘤性疾病的广谱疫苗奠定了理论和实验基础。

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mTERT与mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒对黑色素瘤动物模型的抑瘤效果评价

mTERT与mTyr双启动子联合调控HN基因重组腺病毒对黑色素瘤动物模...

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作者：孟佳丽天津农学院

学位级别：硕士

黑色素瘤(Melanoma)是死亡率较高的恶性肿瘤,在兽医临床上常见于老龄动物,在全球范围内发病率呈逐年上升趋势,其特点是恶性程度高、进展快、易远处转移,是一种对常规治疗药物具有较强抗性,在临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤。基因治... 详细信息

黑色素瘤(Melanoma)是死亡率较高的恶性肿瘤,在兽医临床上常见于老龄动物,在全球范围内发病率呈逐年上升趋势,其特点是恶性程度高、进展快、易远处转移,是一种对常规治疗药物具有较强抗性,在临床治疗过程中颇为棘手的恶性肿瘤。基因治疗成为研究热点,黑色素瘤作为一种浅表性肿瘤,非常适用于基因治疗的观察和研究。本课题组在前期研究中,选择新城疫病毒(NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)基因作为黑色素瘤的治疗基因,将小鼠端粒酶逆转录酶(mTERT)启动子、小鼠黑色素瘤酪氨酸酶(Tyr)特异性启动子核心片段以及HN基因与腺病毒骨架进行同源重组,成功构建肿瘤特异性和组织特异性重组腺病毒Ad-mTERTp-mTyrp-HN。试验中利用前期构建的重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN,经大量扩增和纯化,获得Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和Ad-GFP的滴度分别为10TCID50/mL、10 TCID50/mL、10 TCID50/mL、102.8752.875 TCID50/mL和101.3751.375 TCID50/mL。重组腺病毒Ad-mTERTp-Tyrp-HN体外转染小鼠黑色素瘤B16细胞系,通过观察细胞生长状态和绿色荧光蛋白的表达情况,CCK-8法检测细胞存活率,结果表明,Ad-mTERTp-Tyrp-HN对体外培养的B16细胞的抑瘤作用呈剂量依赖效应和时间依赖效应。通过AO/EB染色、DAPI染色、结晶紫染色,从形态学上明确重组腺病毒抑制肿瘤的方式,结果显示重组腺病毒可不同程度地诱导细胞凋亡。AO/EB染色结果可看到未转染病毒的对照组细胞大多数呈现均匀的绿色(即大多数为正常细胞),只有少量早期凋亡的细胞呈橘红色;而转染Ad-HN、Ad-mTERTp-HN、Ad-mTyrp-HN、Ad-mTERTp-Tyrp-HN和Ad-GFP的细胞出现CPE。经DAPI染色后,腺病毒感染的4组中清晰可见细胞出现CPE,对照组细胞却是均匀一致的亮蓝色,并没有观察到核碎裂等现象。通过细胞划痕试验、细胞侵袭试验检测重组腺病毒对B16细胞迁移侵袭能力;通过扫描电镜检测细胞凋亡,观察到细胞膜皱缩,胞膜起泡或出“芽”,有众多球状凸起小泡形成,呈泡状、多突状或云团状,形态极不规则,并观察到细胞表面光滑的凹陷孔洞,细胞病变明显。本研究构建了BALB/c小鼠荷B16细胞肿瘤模型,并通过尾静脉注射和瘤内注射两种方式探究Ad-mTERTp-Tyrp-HN对B16的抑制作用。尾静脉注射组虽然不能使肿瘤消除,但却使肿瘤生长缓慢。在尾静脉注射48h后,行冰冻切片,于肿瘤组织处可以观察到明显的绿色荧光;荧光定量PCR结果表明Ad-mTERTp-Tyrp-HN能够成倍的提高caspase-3、p21、p53的mRNA表达量。瘤内注射组显示Ad-mTERTp-Tyrp-HN能延长小鼠黑色素模型的中位生存期,生存期长于顺铂治疗组,未引起明显的肝脏、肾脏、脾脏等组织损伤,体重并未减轻;活体成像结果表明,瘤内注射96h后,重组腺病毒仍然可在肿瘤组织处表达,并见明显分布;冰冻切片结果显示,Ad-mTERTp-Tyrp-HN表达组织的荧光强度高于对照组;通过Western blotting检测,重组腺病毒均上调caspase-3、p21、p53蛋白的表达水平,与荧光定量结果一致;TUNEL试验显示,Ad-mTERTp-Tyrp-HN棕色区域占91%;免疫组化结果显示,实验组的caspase-3、p21、p53蛋白阳性率高于对照组(p<0.05)。静脉注射和瘤内注射实验治疗结果显示,虽然两种不同治疗方案均具有抑制实体肿瘤生长的作用,但瘤内注射Ad-mTERTp-Tyrp-HN的治疗效果更为突出。综上所述,Ad-mTERTp-Tyrp-HN在体内体外均具有抑瘤作用,且具有靶向性,呈现明确的抗肿瘤治疗潜力,有望为黑色素瘤的临床治疗提供有效的治疗策略,为进一步利用重组腺病毒治疗疾病奠定基础。

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同方学位论文库评论

融合表达pgsA、CfaB和FliC基因重组乳酸菌的构建及其免疫效果评价

引用

作者：范真玮天津农学院

学位级别：硕士

产毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic ***,ETEC)是引发断奶仔猪腹泻(porcine post weaning diarrhea,PWD)的最主要病原体之一。ETEC菌毛促进细菌附着于肠上皮细胞,同时向肠道释放肠毒素。菌毛CFA/I家族是主要的定居因子抗原(Colonization ... 详细信息

产毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic ***,ETEC)是引发断奶仔猪腹泻(porcine post weaning diarrhea,PWD)的最主要病原体之一。ETEC菌毛促进细菌附着于肠上皮细胞,同时向肠道释放肠毒素。菌毛CFA/I家族是主要的定居因子抗原(Colonization factor antigens,CFAs),也是覆盖大肠杆菌最多血清型的菌毛。CfaB蛋白是CFA/I的主要亚基蛋白,经验证具备优良的抗原性,可诱导机体产生强烈的黏膜免疫。沙门氏菌(Salmonella)是引起人和畜禽发病的病原菌,能够垂直传播给新生畜禽,大动物可终身无症状带菌和散播菌。已有研究显示,沙门氏菌鞭毛蛋白毒力微弱,为已知的抗原,通过TLR5诱导先天免疫反应,并与其他抗原结合进而增强其免疫反应。上述二种细菌常混合感染并加重病情,最终导致肠道环境功能不全的仔猪大批死亡,常给养猪业造成巨大的经济损失。虽然一直利用抗菌药物治疗这两种细菌病,但随着多重耐药菌株(Multi-drug resistant bacteria,MDROS)的出现,抗生素逐渐丧失其原有的治疗能力,因此,研发安全有效的基因工程二联苗是上述疾病较为理想的防控手段。目前,尚未发现联合利用CfaB基因和FliC基因构建乳酸菌的二联基因工程疫苗的相关报道。本试验合成融合表达大肠杆菌CfaB基因、截短的沙门氏菌鞭毛FliC基因以及截短的枯草芽孢杆菌谷氨酸合成酶pgsA’基因,利用T连接酶分别将目的基因连接至表达载体pNZ8048上,获得重组表达载体pNZ8048-pgsA’-CfaB、pNZ8048-pgsA’-FliC和pNZ8048-pgsA’-FliC-CfaB;将三个重组质粒电穿孔转化到乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,***),成功构建重组乳酸乳球菌NZ9000/pNZ8048-pgsA’-CfaB、NZ9000/pNZ8048-pgsA’-FliC和NZ9000/pNZ8048-pgsA’-FliC-CfaB;利用大肠杆菌BL21原核表达并纯化CfaB-His和FliC-His蛋白,并分别制备其多克隆抗体;利用乳链菌素肽(Nisin)诱导重组乳酸菌表达目的蛋白,经Western blotting检测目的蛋白大小与预期相符;乳酸菌口服免疫小鼠,免疫4次,间隔10天,取小鼠血清和小肠黏膜黏液,ELISA结果显示,CfaB、FliC和CfaB-FliC组小鼠小肠黏膜分泌的SIg A显著高于PBS组(P0.05);实验组小鼠血清中细胞因子IL-6显著高于PBS组(P0.05)。本研究成功构建了表达ETEC蛋白CfaB和Salmonella蛋白FliC的重组乳酸乳球菌,可诱导小鼠产生明显的黏膜免疫和细胞免疫反应,为研制临床预防猪大肠杆菌病和猪沙门氏菌病的二联基因工程载体疫苗奠定基础。

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