检索结果-南通市图书馆

作者：普东凯电子科技大学

学位级别：硕士

基因编辑在生命科学领域的科学研究和应用中扮演了越来越重要的角色,近年来,一种抑制CRISPR-Cas系统功能的蛋白——Acr,开始进入我们的视野,并且成为了当前研究的热点。Acr可以保护MGE片段,也可以作为调节基因编辑系统的工具。一些噬菌... 详细信息

基因编辑在生命科学领域的科学研究和应用中扮演了越来越重要的角色,近年来,一种抑制CRISPR-Cas系统功能的蛋白——Acr,开始进入我们的视野,并且成为了当前研究的热点。Acr可以保护MGE片段,也可以作为调节基因编辑系统的工具。一些噬菌体通过Acr对CRISPR-Cas系统的抑制功能,成功地感染细菌并将其遗传材料整合到宿主的基因组中。由于目前我们对Acr的认识还十分有限,科学家们只能使用比较单一的方法在细菌中的基因组中定位大致的Acr,然后通过实验进行验证,费时费力。因此对Acr相关的特征进行系统的分析,设计一套完整的Acr识别系统,将极大地促进我们对Acr的了解和鉴定。为此,我们系统地调查了Acr的特征,结合机器学习的方法,利用决策树构建了一个比较准确的Acr识别系统。在本工作中,我们从五个角度分析了Acr的特征:1)与非Acr蛋白相比,Acr蛋白拥有较短的序列长度,分布在8134aa的范围内;2)在Genbank中,Acr通常被注释为假定蛋白,而非Acr蛋白则有具体的功能;3)大部分的Acr的编码基因(66.7%)都位于基因组岛上,其中81.8%属于prophage;4)与非Acr不同,Acr的下游间隔不远处通常存在HTH结构域;5)Acr的编码基因域非Acr的编码基因在密码子使用偏性上存在显著的差异。为了收集到足够的数据用于构建决策树分类模型,我们通过BLAST和严格的条件筛选,获得了分布于2655个基因组的1413个Acr同源蛋白作为数据集。通过网格筛选和交叉验证,我们获得了最佳的训练参数并构建了决策树分类模型。在交叉验证中,我们的模型获得了为0.91的AUC值。对于正样本,精确率为79%,召回率为81%,f1-score为0.8;在5个独立集测试中,平均精确率达到了64.6%,召回率为90%,f1-score为0.75,并且预测结果的Acr数据均小于10个,这在一定程度上也大大减少了后续实验验证的成本。最后,为了将我们的模型提供给更多的人使用,我们编写了一个完整的Acr预测流程,并创建了一个在线服务网站AcrDetector(http://***/acrDetector),同时,我们还提供了一个本地版本(https://***/pudongkai/***)。

关键词： Anti-CRISPR Acr Acr预测决策树分类模型

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酵母必需基因和联合致死基因的预测

酵母必需基因和联合致死基因的预测

作者：王淑轩电子科技大学

学位级别：硕士

必需基因是对物种的生存和繁殖起重要作用的基因,在破译生命的存活机制中发挥着重要的作用。随着机器学习和生物信息学的发展,研究者在人类和细菌必需基因的预测上已经取得了较好的成果,但是对于酵母必需基因的预测却没有达到像人类和... 详细信息

必需基因是对物种的生存和繁殖起重要作用的基因,在破译生命的存活机制中发挥着重要的作用。随着机器学习和生物信息学的发展,研究者在人类和细菌必需基因的预测上已经取得了较好的成果,但是对于酵母必需基因的预测却没有达到像人类和细菌那么高的准确率。本文提出了密码子特异虚拟寡核苷酸的特征提取方法。这种特征提取的方法考虑邻接和间隔关联的序列,假设间隔一段距离的核苷酸之间也存在相关性,这种相关性正是在染色体的三级结构中真实存在的关系。本文使用上述特征提取的方法,训练传统机器学习模型线性SVM对酵母的必需基因进行了预测,随后使用SVM-RFE+CBR方法进行特征选择,在k为6,λ为3时,在16,384个特征中筛选出1,800个特征用于模型训练。使用网格化搜索的方法对模型参数进行优化,最终使用5折交叉验证在参数C取值10时得到了0.944的AUC。最后RSG方法和Seringhaus的研究进行了比较,该模型在多个指标上都表现优异。联合致死作用是一种基因间的相互作用,以联合致死相互作用为理论基础,可以用于癌症治疗中药物靶标的筛选。为可以获取更多的联合致死基因对,本文以使用SGA技术得到的酵母的具有联合致死相互作用的基因对和无基因间相互作用的基因对作为正样本和负样本组成数据集,使用传统机器学习的方法对酵母的联合致死基因进行预测,其中所使用的特征为上述的新方法。为了使模型的预测性能达到最好,本文首先选择出最合适的参数k为1-7和λ为0-6,然后通过比较不同的模型最终选择了线性SVM,尝试进行特征选择,但是对模型的性能没有明显的改善,最后对模型中的参数进行了优化,在独立测试集上在参数C选择3时取得了AUC为0.850的指标。之后,在深度学习模型上进行了尝试,但未取得较为理想的预测性能。

关键词：必需基因预测机器学习联合致死基因预测间隔的核苷酸关联深度学习

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必需基因理论预测的多种算法研究

必需基因理论预测的多种算法研究

作者：华红丽电子科技大学

学位级别：硕士

研究必需基因对于构建最小基因集、发现潜在的药物靶标和广谱抗菌药物的研发有着非常重要的作用。由于这些基因对于机体生存、繁殖和发育有着不可替代的作用,许多科研工作者不遗余力去探寻必需基因识别的方法。从传统的实验技术到结合... 详细信息

研究必需基因对于构建最小基因集、发现潜在的药物靶标和广谱抗菌药物的研发有着非常重要的作用。由于这些基因对于机体生存、繁殖和发育有着不可替代的作用,许多科研工作者不遗余力去探寻必需基因识别的方法。从传统的实验技术到结合计算基因组学的理论识别方法,必需基因的识别逐渐成为基因组学研究领域的一个热点。我们课题组曾经提出过3款用于必需基因预测的在线服务工具,比如基于同源必需基因和物种进化距离的Geptop,根据基因名称比较进行识别的CEG-Match,从DNA序列中提取序列组成特征去构建人类必需基因预测模型的pheg。在本课题必需基因理论识别研究中,首先从Geptop算法得到启发,将同源必需性的特征与支持向量机(SVM)算法结合起来,以机器学习打分的机制去代替物种进化距离给出的特征权重,自动地去学习每个特征对区分必需基因和非必需基因的重要性度量。对于物种内的必需基因预测,在选择的25个细菌中,通过此方法得到的10-折交叉验证的AUC值(受试者工作特征曲线下面积)最高达到0.9716。对于跨物种必需基因预测,我们则选择在10-折交叉验证中AUC值超过0.90且亲缘关系距离待测物种最近的那个物种为模型训练物种,然后用于待测物种的必需基因预测。通过将预测结果得分和待测物种原始已知的基因必需性进行比较,计算AUC值,最终得到最高0.9552的AUC得分和0.8314的AUC平均得分。在已有的必需基因理论识别算法研究中,这已经是非常不错的预测结果。病原菌必需基因预测有助于发现潜在的抗菌药物靶标,但有意义的抗菌药物不仅能作用于病原菌并抑制其生长,而且对于人体是没有毒副作用的。也就是说,这些药物不能与人类必需基因相互作用。因此,我们需要有效地识别人类必需基因,辅助抗菌药物的合理研发和利用,并有助于人类疾病的治疗。我们获取了人类癌症细胞系必需基因数据,从蛋白质-蛋白质互作网络、基因表达谱数据、GO功能注释三个角度去提取能表征必需基因和非必需基因区别的特征。结合支持向量机去构建预测模型,评估这三种特征对预测人类必需基因的贡献度,分别得到了0.8624,0.8272和0.8706的AUC得分。尽管在后两类特征中有不少的缺失值,但也都得到了不错的预测结果。此外,本文联合这三类特征构建了必需基因预测的集成模型,经过10-折交叉验证,最终得到的AUC值为0.9401,这是目前为止人类必需基因预测得到的最好的结果。本文主要围绕病原细菌和人类必需基因的理论识别问题展开,基于各自的研究现状,分别提取了不同的生物学特征去构建必需基因预测模型,并且都得到了不错的预测结果。但这些方法仍需要不断地研究和拓展,希望获得在必需基因识别领域上能真正得到广泛推广和应用的服务工具。

关键词：必需基因病原菌人类癌症细胞系生物学特征机器学习算法

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病毒蛋白质编码基因预测算法的研究

病毒蛋白质编码基因预测算法的研究

作者：高依舟电子科技大学

学位级别：硕士

对病毒基因组的深入研究在许多方面都有很大帮助,特别是在治疗由病毒感染引起的人类疾病方面。随着病毒数据的快速积累,需要更加有效的基因识别方法来处理和挖掘这些数据。在本文中,我们提出了一个新的病毒基因预测和注释系统——Vgas,... 详细信息

对病毒基因组的深入研究在许多方面都有很大帮助,特别是在治疗由病毒感染引起的人类疾病方面。随着病毒数据的快速积累,需要更加有效的基因识别方法来处理和挖掘这些数据。在本文中,我们提出了一个新的病毒基因预测和注释系统——Vgas,它结合了序列组成和序列相似性比对的方法,可以在基因组序列中自动查找病毒基因并实现基因功能注释。通过测试从Refseq下载的5705个病毒基因组,与现有的程序GeneMarkS,Prodigal和Glimmer做对比,Vgas证明了其优越性,具有最高的平均精确度和召回率(两个指数均比其他程序高1%以上),特别是对于基因组规模较小的病毒物种(≤10kb),它表现出显著的性能(精确度高6%,召回率高2%)。此外,Vgas提供了一个注释功能,用于根据BLASTp比对提供预测基因的功能信息,而且我们还根据这个信息找出了86个refseq数据库缺失的基因数据。另外,测试证明,当Vgas与GeneMarkS、Prodigal结合使用时,可以获得比三个单独程序中的每一个都更好的预测结果,使用这几种不同软件程序的协作预测将是基因预测的更好的方案。现在,Vgas可在http://***/vgas/免费使用。然而Vgas在处理噬菌体数据和双链DNA病毒时效果较差,相比之下精准度和召回率都较低,考虑到这个局限性,我们又尝试使用深度学习方法进行病毒基因识别,本次试验应用了卷积神经网络,设计了共8层网络结构,在使用Uniprot构建的数据集上五重交叉验证进行测试,F值达到了98%,此模型深入研究有机会可以得到弥补当前Vgas不足的新系统。

关键词：病毒基因识别功能注释新基因联合预测深度学习

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原核生物蛋白质编码基因预测算法的研究

原核生物蛋白质编码基因预测算法的研究

作者：华志刚电子科技大学

学位级别：硕士

在DNA序列中获取有用的信息和知识的首要一步就是从基因识别开始。随着全基因组序列数据呈指数级增长,从而导致依靠传统的实验方法无法跟上测序的速度,因此就产生了运用计算机算法来识别基因。在2003年,诞生了一个以DNA序列的Z曲线理论... 详细信息

在DNA序列中获取有用的信息和知识的首要一步就是从基因识别开始。随着全基因组序列数据呈指数级增长,从而导致依靠传统的实验方法无法跟上测序的速度,因此就产生了运用计算机算法来识别基因。在2003年,诞生了一个以DNA序列的Z曲线理论为基础的原核生物基因识别程序ZCURVE 1.0,随后又在2006年,基于同样的Z曲线理论出现了病毒通用性的新算法ZCURVE 1.0。基于实验数据的积累、机器学习理论的发展以及计算机配置的提高,我们有必要对ZCURVE 1.0和ZCURVE 1.0程序分别进行升级,同时还开发了相应的网络服务系统,用户可以访问http://***/zcurve/和http://***/zcurve/免费使用。原核生物基因识别程序ZCURVE 3.0是在ZCURVE 1.0程序基础上改进更新的。改进的地方如下:(1)替代Fisher线性判别为支持向量机(SVM);(2)受ORFs核酸分布的花瓣模式启发,将在训练集中产生六类负样本,进行六次SVM判别,如此改进,将会大大降低算法的伪正预测;(3)在原来的0阶和1阶Z曲线变量基础上加入了2阶和3阶变量,从45个变量增加到765个;(4)对于排除重叠误判的部分,重新对内部参数进行了调优。同理,病毒基因识别程序ZCURVE 1.0更新到了2.0版本。算法中主要改进如下:(1)根据全基因组序列中碱基之间相邻特性扩展特征变量,从最初的33个参数提高到45个参数;(2)基于ORFs分布的花瓣模型原理,根据第一、第二、第三相位构造出六类样本,使得识别算法中进行六次判别;(3)通过逐步调试程序,找出一套最佳的排重叠参数。我们使用ZCURVE 3.0程序测试了337个原核生物全基因组,发现它的准确率(94.0%)比ZCURVE 1.0程序(89.6%)提高了将近4%。与Glimmer 3.02程序相比,ZCURVE 3.0程序的准确率比Glimmer 3.02程序(93.5%)还高,而且ZCURVE 3.0的附加预测率(8.0%)比Glimmer 3.02(11.3%)低3.3%,因此说明,更新后的识别程序ZCURVE 3.0的识别效果不但比ZCURVE 1.0程序提高了,而且还好于Glimmer3.02程序。同理,对于ZCURVE 2.0程序,我们使用了24个病毒基因组进行了测试,ZCURVE 2.0程序(5.79%)的附加预测率比ZCURVE 1.0程序(10.83%)降低了很多,最终与GeneMark S 4.28程序(5.21%)的附加预测率相差不大,并且ZCURVE 2.0程序的准确率(93.94%)比GeneMarkS 4.28程序(88.95%)高很多。最后,我们基于特征变量的基础上还对翻译起始位点预测做了一些研究工作。

关键词：基因识别 ZCURVE程序 ZCURVEV程序准确率附加预测率

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细菌复制链偏差及其内在机制

细菌复制链偏差及其内在机制

作者：赵海龙电子科技大学

学位级别：硕士

由不对称复制方式造成的前导链和滞后链在多种生物特征上体现出了链偏差。随着大规模高通量测序的发展,在越来越多的基因组中发现了该现象,搞清楚两条复制链间的差异对理解复制机制有重要意义,但目前还没有文章系统的研究各类链偏差及... 详细信息

由不对称复制方式造成的前导链和滞后链在多种生物特征上体现出了链偏差。随着大规模高通量测序的发展,在越来越多的基因组中发现了该现象,搞清楚两条复制链间的差异对理解复制机制有重要意义,但目前还没有文章系统的研究各类链偏差及其内在机制。因此本文就细菌复制链偏差进行了全面探讨,整个内容分为以下三个部分:1.对广泛存在于细菌当中的各类复制链偏差做综述和研究。共讨论了5种链偏差,包括基因位置,开放阅读框ORF的数目,碱基组成,碱基替代率以及基因长度。分别对每一种偏差总结了研究现状及偏差内在机制(从突变和选择两方面讨论)并且以Clostridium acetobutylicum ATCC 824为例来分析相关偏差。结果显示前导链和滞后链在ORF数目及基因长度方面没有明显差异,而在其他三个特征中存在显著偏差。2.对于基因组的研究,首先要基于序列组成,组成特征决定了结构特征。因此这部分我们重点研究了链偏差当中的组成偏差及其各种影响因素。结果发现:(1)专性胞内菌比其他细菌在总体上有更强的组成偏差。(2)19个细菌门当中,Fusobacteria的物种具有最强的组成偏差,Firmicutes次之。(3)翻译选择强度和增代时间分别对组成偏差的影响都不明显。(4)与组成偏差存在显著负相关的因素有GC含量,基因组大小,重组率以及COG功能类的A,C,I,Q类。(5)与组成偏差存在强烈正相关的特征有前导链基因密度,COG功能类的D,F,J,L,V类。(6)在所有与组成偏差相关的生物因素中前导链基因密度和COG功能类的C子类贡献率较大。因此链组成偏差的产生与多种因素及其不同比重都有密切关系。3.密码子使用偏性广泛存在于原核生物与真核生物中,具有重要的生物学意义,而在某些细菌中,链组成偏差的程度强烈到足以使前导链和滞后链的基因存在分离的密码子使用。因此,这里建立了一个密码子对应分析数据库CCD。该数据库分别采用对应分析CA和群内对应分析WCA对267个物种进行了研究,结果发现有59个物种的前导链和滞后链基因具有显著的密码子使用偏差。并以达氏螺旋体(Borrelia duttonii Ly)为例介绍了CCD数据库的使用方法。该数据库可以通过网址http://***/services/ccd/免费访问。这篇论文从横向与纵向两个层面就细菌复制链偏差做了详尽探讨,上千个物种的分析结果可以对该问题有一个全面系统的了解。

关键词：链组成偏差密码子使用专性胞内菌 COG功能类基因位置偏差

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细菌必需基因的预测及进化特征的分析

细菌必需基因的预测及进化特征的分析

作者：邓炎炎电子科技大学

学位级别：硕士

必需基因在细菌生存中扮演了一个相当重要的角色,其编码的蛋白质保证了细菌的正常生存和繁殖。在确定了致病菌的必需基因之后,我们可以将其当作治病药物的靶标,从而达到治疗疾病的效果;细菌必需基因的理论研究还有助于我们理解生命的起... 详细信息

必需基因在细菌生存中扮演了一个相当重要的角色,其编码的蛋白质保证了细菌的正常生存和繁殖。在确定了致病菌的必需基因之后,我们可以将其当作治病药物的靶标,从而达到治疗疾病的效果;细菌必需基因的理论研究还有助于我们理解生命的起源和进化。所以,预测细菌的必需基因越来越成为生物信息学的研究重点。在预测细菌必需基因的方法中,实验的方法无疑是最准确的,但是实验周期长,操作麻烦,并且花费巨大,所以到目前为止只有很少的菌种的必需基因被确定出来,因此理论的方法越来越受到重视。本文就以细菌的必需基因为主要的研究对象,采用基于组成特征的理论方法来预测细菌的必需基因。我们首先根据注释文件从大肠杆菌的基因组序列中提取出其组成特征。然后用支持向量机(SVM)和主成分回归(PCR)的方法对组成变量进行分类处理,并用曲线下面积AUC的值来衡量分类器的效果。这也是第一次将主成分回归的方法用于细菌必需基因的预测。得出SVM的AUC为0.83,PCR结果为0.87。接着我们又对两种方法进行改进,在支持向量机方法之前,将组成变量进行特征分析(ttSVM),筛除必需基因和非必需基因没有明显差异的变量。对于主成分回归,加上了核函数(KPCR),提高了其对非线性特征的分类能力。改进后,ttSVM结果最高达0.87,KPCR则为0.84。接着我们将其他所有的已经实验确定必需基因的物种用该四种方法处理,AUC最高达到0.95。最后,我们用AUC大于0.8的物种,建立预测模型,构建了一个免费的网上服务IBEG(http://***/ibeg/),利用该服务,研究人员不但可以运用不同的方法预测未知基因的必需性,也可以对比不同方法的优劣。此外,我们还从功能性基因和水平转移基因两方面,分别对不同物种的必需基因、高密码子使用基因以及高表达基因进行了对比分析。在功能性基因中,必需基因所占的比例最多,说明必需基因中具有功能的基因比较多,功能越是对生命体重要的基因,进化越保守;在水平转移基因中,必需基因所占的比例也是最多,说明必需基因的功能中有一些管家基因,从而容易发生水平转移。综上所述,本文在组成特征上对细菌必需基因的预测做了新方法的处理,增加了新的组成特征,并对其在进化方面做了的研究。但是还有一些问题,需要进一步深入研究,并进一步完善。

关键词：必需基因组成特征机器学习进化

Acr基因数据库的构建与谱系分布等进化分析

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Acr基因数据库的构建与谱系分布等进化分析

作者：曾志电子科技大学

学位级别：硕士

随着CRISRP-Cas技术的普及,对CRISPR-Cas起抑制作用的Acr也逐渐得到关注和研究,以Acr为对象进行研究分析有其重要意义:(1)有研究表明Acr可以有效降低CRISPR-Cas技术的脱靶效应,针对Acr的研究有助于提升CRISPR-Cas技术的可用性和推广其... 详细信息

随着CRISRP-Cas技术的普及,对CRISPR-Cas起抑制作用的Acr也逐渐得到关注和研究,以Acr为对象进行研究分析有其重要意义:(1)有研究表明Acr可以有效降低CRISPR-Cas技术的脱靶效应,针对Acr的研究有助于提升CRISPR-Cas技术的可用性和推广其应用领域。(2)虽然Acr研究较为热门,但目前已发现的Acr序列较少。基于已有的数据分析其特征,这有利于识别更多其他类型的Acr,无疑推动了对Acr的基础研究和应用研究。本文研究主要围绕Acr以及Cas与Acr的关系进行。从文献数据收集开始,截止2020年3月,Acr数据库总共有3627条序列,这包含了69条实验验证的序列和1253条预测序列,剩余的序列是我们基于验证序列同源搜索筛选得到的。这些序列属于8种不同类型,来自46个不同的Acr家族。关于序列的相关信息则统计在6张数据表格中,包含了序列编号、Acr类型、Acr家族以及相关基因信息和蛋白结构信息等。我们在这些数据信息的基础上建立了一个在线数据库网站AcrBank(http://***/AcrBank),该网站主要帮助用户能深入全面地了解其Acr序列,同时还提供了同源比对和关键字搜索功能,方便用户查询感兴趣的内容,以上这些数据都提供打包下载。在已有数据基础上,我们进行了共进化分析和旁侧基因分析。在共进化分析中,我们发现其Cas与Acr的谱系分布并不完全一致,虽然大部分Cas的分布范围大于其对应Acr的分布范围,但有其反例,如AcrVA。同时发现自靶向能作为筛选Acr的特征,但存在Acr不含有自靶向的情况,这反映了Acr在引进时有其复杂的过程。之后我们单独研究了Acr序列,并通过同源搜索和先验准则筛选获取了Acr同源序列。在密码子分析中发现其Acr序列与非Acr序列在密码子使用偏向性上存在明显差异,这表明了Acr可能是近期引入到宿主基因组中。在旁侧保守基因分析中,我们发现在AcrIF、AcrIE和AcrIIA附近很可能存在其保守序列。经过功能域注释后,可看到HTH功能域家族存在于多个不同类型Acr的附近,另外有部分Acr家族存在其独有的功能域,如只有AcrIIA9的附近序列存在其锌指结构域。这些特定的功能域有助于识别筛选新的Acr,对研发识别Acr算法提供了理论支持。

关键词： CRISPR-Cas Acr 数据库共进化分析旁侧基因分析自靶向效应

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多种微生物功能基因的预测和分析

多种微生物功能基因的预测和分析

作者：林丹电子科技大学

学位级别：硕士

微生物功能基因组学的功能分析无论对于微生物自身还是对于阐明高等生物的基因功能和进化特征都很重要。本课题通过对多种微生物的功能基因进行预测和分析,为微生物功能基因的预测和分析工作提供了新的思路和参考。本研究包括以下四个工... 详细信息

微生物功能基因组学的功能分析无论对于微生物自身还是对于阐明高等生物的基因功能和进化特征都很重要。本课题通过对多种微生物的功能基因进行预测和分析,为微生物功能基因的预测和分析工作提供了新的思路和参考。本研究包括以下四个工作:(1)酵母基因组具有生物学意义的开放阅读框(ORFs)的数目一直悬而未决。运用支持向量机LibSVM结合六个生物特征量建立黄金模型对酿酒酵母基因组蛋白质编码基因进行预测。该法的准确性通过十重交叉验证(>99.5%)以及历史回顾对照得到了检验。该工作提供了相应的网络服务并为其它物种功能基因的预测提供了可靠的方法。(2)有研究发现基因的保守性与基因的功能性密不可分。本工作通过运用COG功能分类对DEG数据库中二十种原核生物的必需基因和高表达基因的功能分布进行分析,揭示了基因的功能性与其进化保守性之间的关联。(3)基因的水平转移是促进物种多样性的重要进化因素。本工作通过对DEG数据库中二十种有水平转移基因数据的原核物种的必需性、表达水平与水平转移的重叠度和相关性进行分析,从基因水平转移(HGT)的角度揭示了必需基因和高表达基因的进化特异性。(4)具有重要COG功能的保守基因和水平转移基因都具有复制链定位偏性,我们从该角度对微生物必需基因和高表达基因的进化保守性比较作了补充研究,发现从不同角度进行研究得出的结论也不同。另外对CAI使用局限性的讨论显示单纯用CAI来表示表达水平并不可靠。通过对酿酒酵母基因组的重注释工作,我们提供了一种成功运用支持向量机预测蛋白质编码基因的新方法;从COG功能分类和基因水平转移角度对必需基因和高表达基因的进化研究也为功能基因进化学贡献了新的思路。鉴于在第一个工作中对酿酒酵母基因组重注释取得的良好效果,我们可以试图将这种方法扩展到其他基因的预测当中,如高表达基因、必需基因等,从而为这些基因的相关功能研究提供可靠保障。

关键词：酿酒酵母必需基因高表达基因 COG 水平基因转移

克服大肠杆菌密码子偏好性以提高异源蛋白质表达

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克服大肠杆菌密码子偏好性以提高异源蛋白质表达

作者：靳天悦电子科技大学

学位级别：硕士

大肠杆菌对编码同一种氨基酸的各个密码子的使用频率并不相同,其中,那些不被经常使用的密码子称为稀有密码子。稀有密码子的存在会降低大肠杆菌的翻译水平,这是因为稀有密码子对应的t RNA丰度低。为了提高异源蛋白质的表达,本实验将大... 详细信息

大肠杆菌对编码同一种氨基酸的各个密码子的使用频率并不相同,其中,那些不被经常使用的密码子称为稀有密码子。稀有密码子的存在会降低大肠杆菌的翻译水平,这是因为稀有密码子对应的t RNA丰度低。为了提高异源蛋白质的表达,本实验将大肠杆菌BL21(DE3)稀有密码子对应的t RNA基因插入核糖体操纵子,构建能够动态协调t RNA与氨基酸数量的菌株*** BL21(DE3)-rrn D::6t RNA,该菌株表达的异源蛋白质Cbi A是*** BL21(DE3)表达量的1.49倍,这为工业上克服大肠杆菌密码子偏好性,高效表达异源蛋白质奠定基础。本实验方法是pCas/pTargetF系统,质粒pCas上含有lambda-Red同源重组相关的Exo、Beta、Gam蛋白和Cas9蛋白,发挥切割DNA双链和同源重组的作用;质粒pTargetF上插入N20序列,发挥引导Cas9蛋白切割DNA双链的作用。将大肠杆菌BL21(DE3)稀有密码子对应的6个t RNA基因设计为一个基因片段,送生物公司合成后含有一个碱基突变,采用SOE-PCR方法修复该突变,连接与目的插入位点碱基互补的同源臂,构建打靶片段。质粒pTargetF-N20由Gibson方法构建。打靶片段和质粒pTargetF-N20共转化*** BL21(DE3)-pCas菌株感受态,菌落PCR筛选阳性克隆菌株,得到的阳性克隆菌株提取基因组进行测序,结果与预测一致,说明成功构建了*** BL21(DE3)-rrn D::6t RNA菌株,IPTG诱导去除质粒pTargetF,37℃培养去除温敏型质粒pCas。测量生长曲线,本实验构建的*** BL21(DE3)-rrn D::6t RNA菌株生长曲线与*** BL21(DE3)基本重合,说明增加6个t RNA基因没有破坏大肠杆菌细胞内环境的稳定。同样采用Gibson方法构建质粒pet28a-Cbi A,转化菌株*** BL21(DE3)、*** BL21(DE3)-rrn D::6t RNA。探索诱导异源蛋白质Cbi A表达的最佳条件,确定37℃培养,IPTG终浓度为0.1 m M,诱导时间为4 h时表达量最佳。利用SDS-PAGE和Western-Blot定量检测异源蛋白质Cbi A的表达差异,*** BL21(DE3)-rrn D::6t RNA菌株表达的异源蛋白质Cbi A是*** BL21(DE3)表达量的1.49倍。

关键词：密码子偏好性 pCas/pTargetF系统异源蛋白质表达