检索结果-南通市图书馆

作者：时晓明山东大学

学位级别：硕士

血管性痴呆是由于脑血管疾病和心血管病变的原因导致的获得性、持续性智能障碍综合征,是老年性痴呆中最常见的类型之一,仅次于AD。目前VD的治疗主要针对供血不足、缺血半暗带的脑细胞,通过改善脑循环和脑细胞供氧预防新血栓形成与再梗死... 详细信息

血管性痴呆是由于脑血管疾病和心血管病变的原因导致的获得性、持续性智能障碍综合征,是老年性痴呆中最常见的类型之一,仅次于AD。目前VD的治疗主要针对供血不足、缺血半暗带的脑细胞,通过改善脑循环和脑细胞供氧预防新血栓形成与再梗死,常用的治疗药物有脑循环改善剂、脑能量代谢激活剂、促进胆碱能系统的药物,从治疗的角度来看,没有突破性进展。神经系统损伤后的恢复是一个多环节、多层面的系统整体调节过程。积极探索促进认知功能恢复的治疗策略,仍是基础医学和临床医学的一个重大课题。川芎嗪是中药川芎的主要有效成分之一,具有清除氧自由基、钙拮抗、扩血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用,广泛应用于临床治疗。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成极性和水溶性较大的代谢物而迅速被排出体外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺点。本课题选用的化合物川芎嗪二苯甲基哌嗪(TMPDP),是以氟桂利嗪的主要药效基团二苯甲基-1-哌嗪基甲基基团取代川芎嗪的药代基团2位甲基而合成出的新型川芎嗪烃基哌嗪类衍生物。氟桂利嗪为第2代哌嗪类钙拮抗药,能通过血脑屏障,选择性扩张血管,预防缺血、缺氧引起的细胞内Ca2+超载所致细胞损害,临床上广泛用于心脑血管疾病和外周血管功能不全的防治。以氟桂利嗪的活性基团取代川芎嗪分子的药代基团,以期克服川芎嗪体内半衰期短、生物利用度低等缺点,并通过协同作用增强药效,提高抗心脑血管疾病作用。本论文的第一部分,在细胞水平采用体外细胞实验观察化合物对不同损伤机制造成的神经细胞损伤的保护作用;第二部分,在动物水平采用双侧颈总动脉结扎并降压的方法制作大鼠血管性痴呆模型观察化合物对血管性痴呆大鼠的保护作用,为进一步将TMPDP开发为具有自主知识产权的抗血管性痴呆药物提供理论和实验依据。 1 TMPDP对KCL损伤SH-SY5Y细胞活力的影响采用MTT法检测细胞活力。实验结果显示：SH-SY5Y细胞经KCL(240mmol·L-1)损伤后,细胞活力明显降低(P<0.01)。而同时给予TMPDP后,40,80μmol/L两个剂量组均可明显抑制KCL对神经细胞的损伤程度(P<0.05)。 2 TMPDP对L-Glu损伤SH-SY5Y细胞活力的影响采用MTT法检测细胞活力。实验结果显示：SH-SY5Y细胞经L-Glu (3000μmol·L-1)后,细胞活力明显降低(P<0.01)。而同时给予TMPDP后,20,40μmol/L两个剂量组均可明显抑制Glu对神经细胞的损伤程度(P<0.01)。 3 TMPDP对NaN3损伤SH-SY5Y细胞活力的影响采用MTT法检测细胞活力。实验结果显示：SH-SY5Y细胞经NaN3 (64mmol·L-1)损伤后,细胞活力明显降低(P<0.01)。而同时给予TMPDP后,40,80μmol/L两个剂量组均可明显抑制NaN3对神经细胞的损伤程度(P<0.01)。 4 TMPDP对血管性痴呆模型大鼠行动能力的影响采用低血压反复夹闭双侧颈总动脉4周造成血管性痴呆大鼠模型。前肢抓握实验是动物实验中常用的检查动物行动能力的实验方法。手术后第30日经行前肢抓握实验用以检测实验大鼠行动能力,并进行评分。结果表明：反复结扎双侧颈总动脉后,动物的行动能力有所降低,给予TMPDP治疗后,动物行动能力评分明显提高(P<0.05)。 5 TMPDP对血管性痴呆模型大鼠空间学习记忆能力的影响本实验采用Morris水迷宫检测大鼠的空间记忆能力,包括定位航行实验和空间探索实验两项检测指标。在定位航行实验中,模型组大鼠测试成绩最差,逃避潜伏期比假手术组明显延长(P<0.01);另外空间探索实验中,穿越平台次数和在平台所在象限停留时间均显著减少(P<0.01),表明双侧颈总动脉结扎造成大鼠脑慢性缺血,4周后模型大鼠已出现显著的学习记忆能力损害。给予80mg/kg TMPDP后,大鼠定位航行实验逃避潜伏期明显降低,空间探索实验中,穿越平台次数和在平台所在象限停留时间均显著增高(P<0.01)。 6 TMPDP对血管性痴呆模型大鼠脑内谷氨酸含量的影响收集实验大鼠脑组织匀浆,用考马斯亮蓝法测定细胞内总蛋白量,按谷氨酸含量检测试剂盒说明书测定组织谷氨酸含量。实验结果表明：双侧颈总动脉反复结扎并降压后,大鼠脑组织匀浆中谷氨酸含量明显升高(P<0.01)。与模型组相比,20、80mg/kg TMPDP能够显著降低脑组织中谷氨酸含量(P<0.05)。 7 TMPDP对血管性痴呆模型大鼠脑内MDA、GSH含量和SOD活性的影响收集实验大鼠脑组织匀浆,用考马斯亮蓝法测定细胞内总蛋白量,按MDA、GSH含量检测试剂盒说明书测定组织MDA、GSH含量,按SOD活性检测试剂盒说明书测定组织SOD活性。实验结果表明：双侧颈总动脉反复结扎并降压后,大鼠脑组织匀浆中MDA含

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SHCBP1通过激活EGFR磷酸化和增加与RACGAP1结合应对EGF刺激促进HCC发展的研究

SHCBP1通过激活EGFR磷酸化和增加与RACGAP1结合应对EGF刺激促进HC...

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作者：余冰芳山东大学

学位级别：硕士

研究背景与目的肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常见和最致命的恶性肿瘤之一,通常在确诊时患者已处于晚期阶段,且目前仍然缺乏有效的治疗措施。HCC的发病机制十分复杂,因此寻找新的治疗靶点与生物标志物,进一步阐明HC... 详细信息

研究背景与目的肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界上最常见和最致命的恶性肿瘤之一,通常在确诊时患者已处于晚期阶段,且目前仍然缺乏有效的治疗措施。HCC的发病机制十分复杂,因此寻找新的治疗靶点与生物标志物,进一步阐明HCC发生发展机制进而开发分子治疗新策略,对于HCC患者十分重要。研究报道,SHCBP1在许多肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达,且SHCBP1的异常上调可促进肿瘤的恶性进展。SHCBP1的高表达与乳腺癌、非小细胞肺癌患者的不良预后和生存率较差等临床现象显著相关,提示SHCBP1作为乳腺癌、非小细胞肺癌等肿瘤预后的临床指示性生物标志物具有一定的潜力。SHCBP1在HCC组织和细胞中表达上调,并与HCC的生长呈正相关,但具体机制尚未明确。因此,本文旨在研究SHCBP1对肝细胞癌的增殖、凋亡、细胞周期分布、侵袭和迁移等生物学表型作用,并进一步探究SHCBP1促进HCC发展的机制,为HCC的临床治疗提供新策略。实验方法和结果实验方法:1.生物信息学分析以及检测SHCBP1在HCC组织及细胞中的表达情况首先基于Starbase数据库的数据分析,分析出SHCBP1在HCC组织中高表达,结合KM生存期分析SHCBP1与HCC不良预后的关系。接着,采用HepG2细胞作为HCC体外研究对象,分别提取正常肝上皮细胞L-O2和肝细胞癌HepG2细胞中的总RNA和总蛋白,使用PCR实验和Western blot实验分别检测SHCBP1的mRNA和蛋白表达水平。***1对HepG2细胞增殖、凋亡、细胞周期、侵袭和迁移能力的影响采用lipofectamine-2000试剂转染siRNA敲减HepG2细胞SHCBP1的表达,随后用MTT法分别检测HepG2细胞在培养0h、12h、24h、36h及48h的OD570nm值,采用EdU增殖实验检测HepG2细胞培养48 h时EdU标记阳性细胞的占比,采用平板克隆形成实验分析在转染后第12天细胞克隆形成率,以此来评价SHCBP1对HepG2细胞增殖的影响。采用Hoechst 33342染色法检测HepG2细胞核形态变化,Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率来评价SHCBP1对HepG2细胞凋亡的影响。采用PI单染法检测细胞周期分布变化和Western blot实验检测细胞周期相关蛋白的表达变化来评价SHCBP1对HepG2细胞周期分布的影响。采用细胞划痕法及Transwell实验(不加Matrigel)检测细胞迁移能力的变化和Transwell实验(加Matrigel)检测细胞侵袭能力的变化,采用Western blot实验检测EMT相关蛋白表达的变化,以此评价SHCBP1对HepG2细胞侵袭和迁移的影响。***1影响HepG2细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制研究采用lipofectamine-2000试剂转染siRNA敲减HepG2细胞SHCBP1的表达,随后提取细胞总蛋白,采用Western blot实验检测p-EGFR表达的变化,进一步采用免疫共沉淀实验检测HepG2细胞中敲减SHCBP1表达后p-EGFR与SHCBP1结合状态的变化,最后通过Western blot实验检测p-Shc1和MEK/ERK及PI3K/Akt信号通路蛋白表达的变化,以研究HepG2细胞中敲减SHCBP1表达后对MEK/ERK及PI3K/Akt信号通路的影响。4.在外界EGF刺激条件下,SHCBP1对HepG2细胞周期分布以及增殖相关信号通路的影响采用免疫共沉淀实验证明EGF刺激后SHCBP1与Shc1蛋白结合状态的变化,并进一步解释二者结合状态发生变化的原因。采用Western blot实验检测外界EGF刺激后MEK/ERK及PI3K/Akt信号通路蛋白的表达情况。采用lipofectamine-2000试剂转染siRNA敲减HepG2细胞SHCBP1的表达后,用PI单染法检测细胞周期分布变化,采用Western blot实验检测相应周期相关蛋白表达的变化,以此来评价EGF刺激后,SHCBP1对细胞周期分布的影响。5.在外界EGF刺激条件下,SHCBP1影响HepG2细胞增殖的分子机制研究外界EGF刺激后,SHCBP1逐渐摆脱与Shc1蛋白结合而改变它与其他蛋白的结合状态。首先使用BioGRID数据库的数据预测HCC中SHCBP1可能的结合蛋白,随后基于Starbase数据库分析RACGAP1与SHCBP1的相关性以及RACGAP1在HCC中的表达情况,并结合KM生存期分析RACGAP1与HCC不良预后的关系。采用PCR实验和Western blot实验分别检测肝正常上皮细胞L-O2和肝细胞癌HepG2细胞中RACGAP1的mRNA和蛋白的表达水平。EGF刺激

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消化性溃疡量化评价方法的建立与右旋雷贝拉唑钠药效学研究

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作者：林晓冬山东大学

学位级别：硕士

研究背景与目的消化性溃疡(peptic ulcer,PU)是一种世界范围的常见的消化系统疾病之一。发病率在1.5%到3%之间,每年影响全球约400万人,约有10%的人一生中患过此病。PU可发生于食管、胃或十二指肠,其中以胃、十二指肠最常见。消化道出血... 详细信息

研究背景与目的消化性溃疡(peptic ulcer,PU)是一种世界范围的常见的消化系统疾病之一。发病率在1.5%到3%之间,每年影响全球约400万人,约有10%的人一生中患过此病。PU可发生于食管、胃或十二指肠,其中以胃、十二指肠最常见。消化道出血、穿孔、幽门梗阻和癌变是PU常见的四大并发症。右旋雷贝拉唑钠(R-(+)-rabeprazole sodium,RRS)是雷贝拉唑钠(rabeprazole sodium,RS)旋光异构体的右旋体,是新一代质子泵抑制剂(proton pump inhibitor,PPI)。与其他已上市的PPIs单一旋光异构体相比,RRS具有个体差异小、起效更快、药效持久等优势。有研究报道,在水应激、非甾体抗炎药(例如吲哚美辛、阿司匹林)、幽门结扎等胃溃疡模型中,RRS作用强于左旋雷贝拉唑(S-(-)-rabeprazole sodium,SRS),是RS抗溃疡活性的主要异构体。然而,对PU大鼠模型尚未有系统的量化评价方法的文献报道。除此之外,RRS对大鼠糜烂性食管炎模型、十二指肠溃疡模型的药效学研究也未见文献报道。对于急性胃出血、休克、消化道手术、疾病应激性等重症患者,有必要开发RRS的无菌粉末型注射剂。在本论文中,我们运用糜烂性食管炎、胃溃疡、十二指肠溃疡模型,通过与SRS、RS对比,系统探究了 RRS的药效学作用。并且运用对比的方法,进行了图像量化评价方法的发现、建立、应用等方面的研究。通过与传统评价方法的对比,发现图像量化评价法用于PU模型药效学研究评价具有较强的优势、适用性和科学性。本论文首次建立了适用于PU模型评价及质子泵抑制剂类药物疗效评价的数字图像量化评价方法;首次运用图像量化评价法系统性研究了 RRS抗PU的药效作用,为抗PU类药物的系统性评价提供新的科学的研究方法和评价基础。实验方法分别复制大鼠糜烂性食管炎模型、幽门结扎型胃溃疡模型,乙酸型十二指肠溃疡模型,分别以 RRS 0.9、1.8、3.6mg·kg-1、SRS 1.8mg·kg-1 和 SS 3.6mg·kg-1的剂量实施治疗干预。经过定标、二值化、去背景、阈值设定、数据获取等图像处理过程,建立ImageJ图像量化评价法,获取溃疡面积、溃疡占比等关键指标。通过组间比较胃酸总分泌量、pH值、食管炎损伤面积、食管炎损伤占比、胃溃疡面积、胃溃疡占比、十二指肠溃疡面积等指标,评价RRS、SRS和RS的抗PU作用。通过类比的方法,探讨ImageJ图像量化评价法和传统分级计分法用于实验性溃疡研究的差异。1.胃液分泌功能实验70只大鼠随机分为7组后,药物干预组经尾静脉注射相应的药液1次,模型对照组和假手术组同法给予0.9%氯化钠注射液。给药完毕1h后,各组大鼠麻醉后,手术造模。术后将动物5 h后,收集胃液,测定胃蛋白酶活力,酸碱滴定法测定胃总酸含量,比色法测定酶解还原产物的吸光度,计算胃酸总分泌量、pH值及胃酸分泌抑制率、胃蛋白酶活力。2.糜烂性食管炎实验70只大鼠随机分为7组后,麻醉后,手术造模。各药物干预组经尾静脉注射相应的药液1次,模型对照组和假手术组给予等容量的0.9%氯化钠注射液。给药24 h后,分离并剪取食管,进行大体评分。采集组织黏膜数码图像,进行图像量化评价,获取食管损伤面积和食管损伤占比。3.幽门结扎型胃溃疡实验70只大鼠随机分为7组后,各药物干预组经尾静脉注射相应的药液1次,模型对照组和假手术组给予等容量的0.9%氯化钠注射液。麻醉后,手术造模。手术18 h后,摘取大鼠全胃,测量判定胃黏膜面溃疡程度,计算胃溃疡指数、胃溃疡抑制率。采集组织黏膜数码图像,进行图像量化评价,获取胃溃疡面积和胃溃疡占比。4.乙酸型十二指肠溃疡实验70只大鼠随机分为7组后,麻醉后手术,乙酸法复制十二指肠溃疡。各组大鼠经尾静脉注射相应的药物溶液,每天给药1次,连续7天。模型对照组和假手术组同法给予0.9%氯化钠注射液。末次给药后,麻醉处死,取出胃及十二指肠上部。分别采用直接测量法和图像量化评价法进行溃疡面积的测量。实验结果***对大鼠胃液分泌和胃蛋白酶活力的影响酸碱滴定法的结果表明,与模型对照组比较,RRS1.8、3.6 mg·kg-1组可显著抑制幽门结扎型模型的胃总酸分泌量,升高胃液pH值(P0.05)。RRS组的胃酸分泌抑制率和胃溃疡抑制率均高于等剂量的SRS组和RS组。***对大鼠食管炎的作用(a)分级评分法:EE模型大鼠单次尾静脉注射给药24 h后,与模型对照组比较,RRS 1

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川芎嗪茋类衍生物DLJ14和阿霉素合用抑制MCF-7/A细胞体内外增殖作用的机制研究

川芎嗪茋类衍生物DLJ14和阿霉素合用抑制MCF-7/A细胞体内外增殖作...

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作者：陈金花山东大学

学位级别：硕士

川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是伞形科蒿本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort根茎中分离提纯的一种生物碱为中药川芎的有效活性成分之一。目前已有很多文献报道TMP具有逆转肿瘤多药耐药的活性,但由于甲基易被氧化而导致其半衰... 详细信息

川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是伞形科蒿本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort根茎中分离提纯的一种生物碱为中药川芎的有效活性成分之一。目前已有很多文献报道TMP具有逆转肿瘤多药耐药的活性,但由于甲基易被氧化而导致其半衰期短、生物利用度低,限制其临床应用。为了克服其缺点,我们合成了一系列川芎嗪芪类衍生物并筛选出具有较好活性的DLJ14((E)-2-(2,4,-二甲氧基苯乙烯基)-3,5,6-三甲基吡嗪)。前期实验结果已经证实：DLJ14能逆转人慢性粒细胞性白血病耐阿霉素细胞株K562/A02和人乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/A对阿霉素的耐药性。但是,DLJ14和阿霉素合用后提高阿霉素抗肿瘤作用的机制并没有完全阐明。本课题将进一步探讨川芎嗪芪类衍生物DLJ14和阿霉素合用对人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF-7/A体内外增殖的抑制作用及作用机制。首先,体外MTT实验表明：DLJ14和阿霉素合用能明显增强对MCF-7/A细胞的抑制作用,与阿霉素单用组比较有显著性差异。体内裸鼠荷瘤实验表明：与阴性对照组相比,DLJ14单用(4mg/kg,8mg/kg)和阿霉素(lmg/kg)单用对阿霉素耐药移植瘤的增殖抑制作用弱;而DLJ14(4mg/kg,8mg/kg)和阿霉素(1mg/kg)联合用药对阿霉素耐药移植瘤的生长有显著抑制作用,与阿霉素单用组相比具有显著的统计学意义。细胞周期实验显示DLJ14和阿霉素合用能将MCF-7/A细胞阻滞在G2/M期,该阻滞作用与升高P53蛋白和P21蛋白表达,降低Cyclin A蛋白表达有关。Hoechst33258染色实验和Annexin V-FITC/Propidium iodide (PI)双染实验结果表明：与单用阿霉素比较,DLJ14和阿霉素合用能显著诱导MCF-7/A细胞凋亡,呈现明显的染色质浓缩、聚集在核周边或核膜破裂的现象,晚期凋亡细胞数显著增多。Western blotting检测凋亡相关蛋白表达,结果显示：Bax/Bcl-2比率、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白量均明显增多。JC-1检测细胞线粒体膜电位和Western blotting分别检测线粒体和胞浆中cytochrome c蛋白量,结果显示：与单用阿霉素比较,DLJ14和阿霉素合用组去极化线粒体的细胞比例增多,即细胞线粒体膜电势降低,cytochrome c从线粒体释放到胞浆,表明MCF-7/A细胞发生凋亡可能通过线粒体通路。进一步对细胞生长相关信号通路进行分析,结果显示DLJ14和阿霉素合用可抑制细胞EGFR和PI3K蛋白的表达及细胞存活信号EGFR和Akt的磷酸化,而对非磷酸化Akt蛋白的表达量无影响。上述结果表明DLJ14和阿霉素合用后可通过抑制EGFR/PI3K/Akt细胞存活信号通路来诱导线粒体介导的细胞凋亡,加强阿霉素的细胞毒作用。其次,探讨了DLJ14对ABC超家族耐药相关蛋白P-gp和BCRP的影响。P-gp底物罗丹明123细胞内蓄积实验表明：与单用阿霉素比较,DLJ14和阿霉素合用组中罗丹明123的荧光强度明显增强,即罗丹明123外排减少,细胞内蓄积增多。细胞内ATP含量测定和细胞中Ca2+-Mg2+ATPase活性检测表明：与单用阿霉素比较,DLJ14和阿霉素合用组中ATP含量和Ca2+-Mg2+ATPase活性均显著降低。Western blotting进一步分析显示：与单用阿霉素比较,DLJ14和阿霉素合用后能明显降低细胞中ERK、P-ERK、P-gp和BCRP蛋白的表达。上述结果表明DLJ14和阿霉素合用能通过抑制ABC超家族耐药相关蛋白P-gp和BCRP的功能和蛋白表达来发挥作用。综上所述,DLJ14和阿霉素合用可通过抑制EGFR/PI3K/Akt细胞存活信号通路来诱导线粒体介导的细胞凋亡和抑制ABC超家族耐药相关蛋白P-gp和BCRP的功能和蛋白表达来发挥抗耐药肿瘤细胞生长作用。

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血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞中抑癌基因PTEN的影响及分子机制研究

血管紧张素Ⅱ对血管平滑肌细胞中抑癌基因PTEN的影响及分子机制研...

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作者：董雪山东大学

学位级别：硕士

血管平滑肌细胞（vascular smoooth muscle cell, VSMC）位于动脉血管中膜,是血管中层唯一的细胞成分。VSMC的异常增殖,导致其由中膜迁移到内膜下间隙,是冠状动脉硬化、经皮穿刺腔内冠状动脉成形术再狭窄以及高血压血管肥厚等疾病的病... 详细信息

血管平滑肌细胞（vascular smoooth muscle cell, VSMC）位于动脉血管中膜,是血管中层唯一的细胞成分。VSMC的异常增殖,导致其由中膜迁移到内膜下间隙,是冠状动脉硬化、经皮穿刺腔内冠状动脉成形术再狭窄以及高血压血管肥厚等疾病的病理基础。因此找到VSMC异常增殖的机制,抑制VSMC异常增殖是治疗这些血管肥厚性疾病的重要途径。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN）是近年来发现的一种新的抑癌基因,是具有双重磷酸酶活性的肿瘤抑制因子,在中枢神经系统、心脏、肝脏、肾脏、胃肠道、肺脏及皮肤等全身多器官均有表达,且参与多种生理过程,尤其是对肿瘤细胞的生长、增殖、分化、凋亡、粘附和迁移均具有重要影响。近年来,对PTEN的研究逐渐从肿瘤领域延伸到其他领域中,随着研究的深入人们发现PTEN在心肌肥大,高血压,动脉粥样硬化,支气管哮喘哮等疾病中也发挥重要的作用。本课题应用血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ, AngⅡ）诱导血管平滑肌细胞增殖和迁移,从细胞和分子水平深入探讨AngⅡ是否影响平滑肌细胞中抑癌基因PTEN的活性和表达以及其下游信号通路,发挥促血管平滑肌细胞异常增生和迁移的作用。并且初步探讨血管平滑肌细胞增殖中PTEN的表达如何被调控。一、血管紧张素Ⅱ促进平滑肌细胞增殖和迁移,抑制凋亡应用MTT法,CCK-8法及划痕实验,证实AngⅡ可以促进平滑肌细胞的增殖与迁移,并且确定了AngⅡ的最佳浓度和作用时间。经MTT法检测细胞活力,发现1μmol/L以及10μmol/L两个浓度的AngⅡ作用12小时和24小时后均能显著促进平滑肌细胞增殖,而0.1μmol/L AngⅡ作用不及另两个浓度。1μmol/L AngⅡ增殖促进率为12小时13.6%（p＜0.001）,24小时13.9（p＜0.01）,作用稳定。再经CCK-8法确证1μmol/L的AngⅡ在24小时内呈时间依赖性的促进平滑肌细胞增殖,12小时和24小时对平滑肌细胞增殖的促进率分别为10.4%（p＜0.01）和9.8%（p＜0.05）。划痕实验的结果显示,1μmol/L的AngⅡ在12小时内呈时间依赖性的促进平滑肌细胞迁移,12小时后AngⅡ组平滑肌细胞迁移的距离约为正常组的1.7倍（p＜0.05）。在检测AngⅡ影响细胞活力的同时,应用免疫印记法检测了细胞中caspase-3的表达,来反映细胞凋亡水平。结果显示,12小时内1μmol/L的AngⅡ可使平滑肌细胞中Caspase-3蛋白的表达呈时间依赖性的减少,降低细胞的凋亡水平。二、血管紧张素Ⅱ对平滑肌细胞中PTEN及其通路的影响实验应用western blot检测法及非还原电泳法检测AngⅡ刺激细胞后,PTEN, phospho-PTEN （p-PTEN）, reduced-PTEN （re-PTEN）, oxidized-PTEN （ox-PTEN）及PTEN下游通路蛋白phospho-Akt （p-Akt）和phospho-FAK （p-FAK）表达的变化。同时应用Realtime-PCR法检测PTEN mRNA水平的变化。此外,应用还原型二氯荧光素（2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA）检测细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平的变化,考察自由基水平与re-PTEN和ox-PTEN表达的关系。结果显示,0.1μmol/L, 1μmol/L以及10μmol/L的AngⅡ分别作用于血管平滑肌细胞24h时,细胞内PTEN蛋白的表达水平呈浓度依赖性降低。选用1μmol/L的AngⅡ作用于平滑肌细胞0-12h, PTEN的表达呈现时间依赖性的降低,12h时,其表达降低至正常对照组的1/4（p＜0.001）o RT-PCR的检测结果显示lμmol/L　AngⅡ刺激细胞2h后PTEN mRNA水平已降低至对照组的1/2（p＜0.01）。说明AngⅡ可以从基因和蛋白水平降低PTEN的转录和表达。应用western blot方法检测到,AngⅡ刺激平滑肌细胞5min后可快速却短暂的升高p-PTEN的表达,2小时后趋于正常水平。向细胞内载入DCFH荧光探针,用Ang II刺激后不同时间检测到的细胞内荧光强度反映细胞内活性氧水平。结果显示,AngⅡ刺激平滑肌细胞可以快速升高细胞内活性氧的水平,1小时后达到对照组的1.5倍（p＜0.01）,持续升高2小时后逐渐降低,12小时后基本恢复正常氧化还原状态。这与1μmol/L的AngⅡ作用于平滑肌细胞2h,应用非还原电

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新型微管抑制剂6a对耐药肿瘤细胞KB/V的生长抑制作用研究

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作者：张颖山东大学

学位级别：硕士

研究背景与目的多药耐药(MDR)是指耐药肿瘤对结构与功能部分或完全不相关的抗肿瘤药物表现显著抗药性。研究表明,多药耐药现象是导致恶性肿瘤化疗失败的关键原因。化疗药物的临床广泛应用过程中出现的多药耐药现象,严重限制药物的治疗... 详细信息

研究背景与目的多药耐药(MDR)是指耐药肿瘤对结构与功能部分或完全不相关的抗肿瘤药物表现显著抗药性。研究表明,多药耐药现象是导致恶性肿瘤化疗失败的关键原因。化疗药物的临床广泛应用过程中出现的多药耐药现象,严重限制药物的治疗效果与应用周期。口腔癌是一种严重的、死亡率高的恶性肿瘤疾病。长春新碱(vincristine)是治疗口腔癌的基础化疗药物之一,多药耐药现象是降低长春新碱对口腔癌临床疗效的主要因素。与靶向紫杉醇类结合位点(如紫杉醇)或长春碱类结合位点(如长春新碱)药物相比,靶向秋水仙碱结合位点的化合物可能具有克服P-gp调控的肿瘤多药耐药的化学结构优势。6a是一种能与秋水仙碱结合位点展现高亲和力的新型化合物。在本论文中,我们筛选了 6a对多种敏感株及其耐药株肿瘤细胞的抗肿瘤活性,在此基础上探讨了 6a对长春新碱耐受的人口腔癌表皮样细胞KB/V的生长抑制作用及分子机制。实验方法1.6a对耐药肿瘤细胞株的体外活性检测。采用MTT法检测多种耐药细胞(BEL7402/5-FU,MCF-7,KB/V)的耐药性,在确定细胞具有稳定耐药性的基础上,采用MTT法、克隆形成方法检测了 6a与秋水仙碱对多种耐药细胞的生长抑制作用。2.6a对耐长春新碱的人口腔癌细胞(KB/V)的体内生长抑制作用。选用裸鼠移植瘤模型检测6a对KB/V细胞移植瘤的生长抑制作用。3.6a的作用靶点检测。选择罗丹明123(Rh123)胞内蓄积实验和western blotting法检测6a对P-gp蛋白的外排功能和表达量的影响;采用α-tubulin免疫荧光染色法检测6a和秋水仙碱对微管蛋白聚合的抑制作用。4.探讨6a对KB/V细胞生长抑制作用的分子机制。采用流式实验检测细胞周期分布(PI染色法),细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI染色法)和线粒体膜电位(JC-1染色法);采用Hoechst 33342核酸染色法观察细胞的形态学改变;采用western blotting法考察6a对PTEN介导的信号通路的影响。实验结果1.体外抗增殖实验结果表明6a具有比秋水仙碱更优越的抗KB/V细胞增殖活性。更重要的是其对耐药细胞株BEL7402/5-FU和MCF-7/A的生长抑制作用微弱,显示出6a对KB/V细胞具有明显的抗肿瘤选择性。2.体内移植瘤实验结果显示腹腔注射给药剂量30 mg/kg的6a能显著抑制KB/V细胞移植瘤的生长(抑瘤率为75.8%)且无明显的毒性反应。3.6a能明显抑制KB/V细胞微管蛋白聚合、诱导G2/M期阻滞、细胞凋亡(线粒体依赖的凋亡途径)及下调PTEN/AKT/NF-κB信号通路。反之,6a对P-gp蛋白的外排功能及表达均无明显影响。4.6a对KB/V细胞的抗增殖作用可能的分子机制:靶向秋水仙碱结合位点抑制微管蛋白的聚合;通过上调cyclinB1的表达及下调cdc-2,p-cdc2,cdc25B的表达促使细胞阻滞于G2/M期;诱导线粒体膜电位降低,下调Bcl-2/Bax的比率,促进细胞色素C的释放和caspase 9,PARP的活化激活线粒体依赖的细胞凋亡通路;通过促进PTEN的去磷酸化,下调p-Akt,NF-κB的表达抑制PTEN/AKT/NF-κB信号通路的激活。实验结论体内外实验发现,6a对耐药肿瘤细胞KB/V具有很强的生长抑制作用和促进线粒体途径依赖的细胞凋亡作用。作用机制与诱导G2/M期阻滞,抑制KB/V细胞内微管蛋白聚合及调控PTEN/AKT/NF-κB信号通路有关。研究意义6a有望成为一种应用于长春新碱耐药的人口腔上皮癌的临床化疗药物。

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化合物6r体内外抗肿瘤活性及作用机制研究

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作者：张鹏山东大学

学位级别：硕士

研究背景依他尼酸(EA)是一种谷胱甘肽转移酶(GSTπ)抑制剂,具有较弱的抗肿瘤活性。但由于EA生物利用度低,副作用大,限制了其在临床的进一步应用。根据生物等电子重排原理,我们设计并合成了一系列EA嗯二唑衍生物,通过筛选,发现化合物5-[2... 详细信息

研究背景依他尼酸(EA)是一种谷胱甘肽转移酶(GSTπ)抑制剂,具有较弱的抗肿瘤活性。但由于EA生物利用度低,副作用大,限制了其在临床的进一步应用。根据生物等电子重排原理,我们设计并合成了一系列EA嗯二唑衍生物,通过筛选,发现化合物5-[2,3-二氯-4-(2-亚甲基-1-代丁基)氯苯]-3-甲基-1,2,4-噁二唑(6r)具有较高的抗肿瘤活性,具有进一步研究成为抗肿瘤药物的价值。实验方法体外实验：MTT法评价化合物6r对一系列肿瘤细胞增殖的抑制作用,并选取敏感细胞株人结肠癌SW620细胞及人前列腺癌PC3细胞进一步研究。Hoechst33258染色法,FITC-AnnexinV/PI双染法检测6r对肿瘤细胞凋亡的影响;碘化丙啶(PI)单染法检测6r对肿瘤细胞周期的影响。Western blotting法检测6r对肿瘤细胞中GST71, EGFR, PI3K/Akt信号通路分子及周期蛋白Cyclin D1表达水平的影响。体内实验：分别构建裸鼠皮下接种结肠癌SW620细胞移植瘤,皮下接种前列腺癌PC3细胞移植瘤以及原位接种标靶荧光素酶基因前列腺癌PC-3M-Luc-C6细胞移植瘤模型,以6r治疗组,5-氟尿嘧啶(5-Fu)或米托蒽醌(Mitoxantrone, MA)阳性对照组及溶剂阴性对照组进行裸鼠实验。采用尾静脉方式给药,隔天给药并连续给药数周。实验结束后,处死裸鼠,取出肿瘤并称重,通过与阴性对照组比较评价6r体内抗肿瘤活性。Western blotting法检测6r对肿瘤组织中GSTπ,凋亡相关蛋白Caspase-3, bcl-2/Bax, Cyt-C及EGFR/PI3K/Akt表达的影响实验结果体外实验结果：体外生长抑制试验结果表明,6r对大多数肿瘤细胞具有较强的抑制作用,对SW620及PC3肿瘤细胞半抑制率IC50分别为4.89μM和3.79μM,选取敏感肿瘤细胞株PC3及SW620进一步实验。Hoechst33258染色结果显示,2μM,4μM6r可明显诱导肿瘤细胞凋亡。荧光显微镜观察,SW620及PC3细胞核染色质浓染,固缩或聚核膜周边,或呈块状碎裂改变。FITC-AnnexinV/PI双染法试验结果表明,4μM6r处理SW620及PC3肿瘤细胞24h凋亡率分别为28.8%和29.41%。PI单染法实验结果表明,4μM6r处理SW620细胞,处于S期的细胞数比例显著增加至66.85%;8μM6r处理PC3细胞,处于S期的细胞数比例显著增加至22.79%,证明6r可阻滞肿瘤细胞周期于S期。Western blotting结果显示,6r对SW620细胞及肿瘤组织中GSTπ的表达无明显影响,8μM6r可显著增加抑制PC3细胞中EGFR/PI3K/Akt及Cyclin D1的表达水平。体内实验结果：裸鼠移植瘤实验中,与阴性对照组比较,以8mg/kg剂量尾静脉注射给药3周后,6r对结肠癌SW620皮下移植瘤生长抑制率为44.17%;给药3周后,6r对前列腺癌PC3皮下移植瘤的生长抑制率为63.3%;给药4周后,对原位前列腺癌PC-3M细胞移植瘤抑制率为60.5%,且无明显副作用。动物实验结果证明6r具有较强的体内抗肿瘤活性。Western bolotting结果显示,6r对SW620肿瘤组织中GSTπ的表达无明显影响。6r可显著增加裸鼠肿瘤组织中cleaved-caspase-3的表达水平,促进线粒体内细胞色素C的释放,增加Bax的表达而下调bcl-2的表达,使两者比例降低,抑制EGFR/PI3K/Akt蛋白的表达。结论化合物6r具有较强的体内外抗肿瘤活性,其可能的作用机制是通过靶向EGFR,抑制EGFR的表达及PI3K/Akt信号通路,通过bcl-2/Bax-Cyt-C-caspase-3线粒体介导的凋亡通路诱导肿瘤细胞凋亡。同时,6r通过下调周期蛋白Cyclin D1的表达,阻滞肿瘤细胞周期于S期,抑制肿瘤细胞的增殖。因此,6r有潜力成为抗癌的候选药物之一。

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吲哚类HDAC6/Tubulin双靶点抑制剂的筛选及其抗白血病作用研究

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作者：乔兴慧山东大学

学位级别：硕士

研究背景与目的吲哚化合物存在于很多植物中,特别是十字花科蔬菜,例如:西蓝花、卷心菜、花椰菜,而食用十字花科蔬菜有助于抵抗癌症,导致许多癌症发病率的降低,例如前列腺癌,肺癌,乳腺癌和结直肠癌。癌症作为严重威胁人类健康的疾病之一... 详细信息

研究背景与目的吲哚化合物存在于很多植物中,特别是十字花科蔬菜,例如:西蓝花、卷心菜、花椰菜,而食用十字花科蔬菜有助于抵抗癌症,导致许多癌症发病率的降低,例如前列腺癌,肺癌,乳腺癌和结直肠癌。癌症作为严重威胁人类健康的疾病之一,近年来随着生活节奏的加快,其发生率也逐渐上升。每年全球因癌症死亡的人数多达820万,据世界卫生组织报告,到2030年,患癌人数将达到2360万。已有研究表明,吲哚类化合物,在抗肿瘤方面表现出的良好生物活性,通常通过调节细胞周期,诱导凋亡,抑制血管生成和抑制细胞侵袭发挥抗癌作用。目前已经开发了多种吲哚类抗肿瘤药物应用于临床。在本论文中,我们通过筛选一系列吲哚化合物,发现抗癌效果较好的化合物3ab。在药效学评价方面,研究其对白血病细胞K562和HL-60的增殖,凋亡,细胞周期,侵袭和自噬的影响。通过分子对接模拟实验筛选其作用靶点,并在细胞和分子水平进行验证。进一步探讨化合物3ab抗白血病的分子机制并在体内评估化合物对K562移植瘤生长的抑制效果。实验方法1.筛选具有抗癌活性的吲哚化合物。MTT法以顺铂(Cis,platin,DDP)作为阳性对照,筛选出具有抗癌活性的吲哚类化合物。检测化合物对HT-29、A549、K562细胞的抑制作用,然后筛选出抗癌活性最佳的化合物。2.确定对化合物3ab敏感性强的癌症类型。MTT法以DDP作为阳性对照,检测活性化合物3ab和3ai对多种肿瘤细胞(A549、H460、K562、HL-60、HT-29、B16、K562、MDA-MB-232、BGC-823、PC-3)的毒性。3.检测化合物3ab对人正常细胞的毒性。MTT法以DDP作为阳性对照,检测化合物3ab对人脐静脉内皮细胞HUVECs、人正常胃粘膜细胞GES-1的抑制作用。4.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞形态的影响。采用倒置显微镜观察化合物3ab对K562和HL-60形态的影响。5.检测K562和HL-60细胞对化合物3ab的摄取。通过流式细胞仪检测K562和HL-60细胞对化合物3ab的摄取情况。6.检测化合物3ab诱导K562/HL-60细胞凋亡的情况。Hoechst 33342法检测化合物3ab诱导K562和HL-60细胞凋亡的情况。Annexin V-FITC/PI染色后,利用流式细胞仪量化化合物3ab诱导的K562细胞的凋亡情况。进一步采用JC-1荧光探针法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对线粒体膜电位变化情况。最后采用Western blotting方法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对凋亡相关蛋白水平的影响。同时采用DCFH-DA荧光探针法检测化合物3ab作用K562和HL-60细胞后对ROS水平的影响。7.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞周期分布的影响。PI染色后,经流式细胞仪检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后,周期分布是否发生变化。同时,采用Westernblotting方法检测化合物3ab对G2/M期相关蛋白CDK1和Cyclin B1表达水平的影响。8.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞侵袭能力的影响。Transwell侵袭实验检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后,侵袭能力是否发生变化。9.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞自噬水平的影响。吖啶橙染色法检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后,自噬水平是否发生变化。10.采用计算机模拟技术筛选化合物3ab的作用靶点。采用计算机模拟技术进行吲哚相关靶点蛋白与化合物3ab的对接模拟,对化合物3ab在K562和HL-60细胞中的可能作用靶点进行筛选。11.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞微管蛋白的影响。免疫荧光实验检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后,微管蛋白是否发生变化。然后,通过EBI竞争性结合实验检测化合物3ab是否是通过作用于微管蛋白秋水仙碱位点来发挥周期阻滞作用。12.检测化合物3ab对K562和HL-60细胞中HDAC6蛋白及相关通路蛋白的影响。Western blotting方法检测K562和HL-60细胞经不同浓度的化合物3ab处理后,HDAC6蛋白及相关通路蛋白表达量是否发生变化。13.检测化合物3ab对裸鼠K562移植瘤的生长抑制作用。通过皮下注射人慢性髓原白血病K562细胞,小鼠移植瘤模型建立,每三天尾静脉给药一次并且连续18天,每天观察裸鼠状态,并且每三天记录一次裸鼠体重,瘤长,瘤宽。待实验结束,刨出移植瘤,称重并拍照保存,并将移植瘤一部分进行冷冻切片后免疫荧光染色,观察微管蛋白的变化,另一部分提蛋白后Western blotting方法检测HDAC6水平的变化。实验结果1

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A公司汽车后市场项目规划研究

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作者：关振山吉林大学

学位级别：硕士

由于中国汽车的高速发展已经持续很长时间,总量已经达到非常大的体量,由于政策、环保、交通等诸多原因,不可能一直维持高速的发展。汽车配套市场作为汽车主机厂的配套商,竞争更为激烈,资金占用大,回款周期长,利润低,已经属于红海产业,... 详细信息

由于中国汽车的高速发展已经持续很长时间,总量已经达到非常大的体量,由于政策、环保、交通等诸多原因,不可能一直维持高速的发展。汽车配套市场作为汽车主机厂的配套商,竞争更为激烈,资金占用大,回款周期长,利润低,已经属于红海产业,配套企业面临技术升级和产业转型的发展难题。作为汽车后市场则不同,它从人们购买一辆车后,就会伴随车辆终生。从日常的保养维护,车辆保险,消耗品、易损件更换,故障维修,车内用品使用,汽车节能降耗,智能化控制和改造,二手车辆交易,车辆资源整合等等,都需要专业机构和人士提供专业服务。相比国外发展多年成熟的汽车后市场,在国内尚是萌芽初发,如何实现从单纯的制造、零件等硬件配套逐步向服务型配套转变,寻找并抓住巨大的汽车后市场商机,是企业发展至关重要的契机。汽车后市场细分领域非常多,其中汽车维护保养占的规模就已经超过千亿元,因为国内汽车后市场维护保养发展时间不长,发展方式还是处在初级阶段。消费者在汽车维修保养方面的痛点很多,各种服务都面临着窘境:找4S店维修,但原厂配件价格居高不下;找普通维修工厂,虽然价格低,但又担心维修备件质量不好。物美价廉的,性价比的售后备件及维修企业是市场发展的需要。国家倡导互联网+的概念,物美价廉、公开透明、高性价比的O2O模式,应该是未来维护保养的发展新方向。本文通过对A公司现有汽车配套的现状及存在的风险,进行识别、评估,给出风险的解决策略,从而为A公司的长远健康发展决策提供客观的依据,并由此推动A公司汽车后市场的建设和发展。主要研究方向包括:初步确定基于庞大的汽车市场容量,建立O2O模式的研发、制造专业汽车售后及维修部件;根据汽车快修市场的特点,结合企业的技术特点,采用互联网+的形式,从事汽车快修业务。寻找企业发展的最佳方案和途径,并制定具体的模式分析及可行性报告,为A公司未来建立可持续发展模式提供理论依据。

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川芎嗪烃基哌嗪衍生物CXC137对NMDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤及血管性痴呆模型大鼠保护作用研究

川芎嗪烃基哌嗪衍生物CXC137对NMDA诱导的SH-SY5Y细胞损伤及血管...

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作者：张浩山东大学

学位级别：硕士

血管性痴呆是发生在脑血管基础上的以记忆、认知功能缺损为主,或伴有语言、视空间技能及情感或人格障碍的获得性智能持续性损害的综合征。血管性痴呆产生原因多为脑梗塞导致脑缺血-再灌注引起的脑实质损伤。当今研究表明：兴奋性氨基酸... 详细信息

血管性痴呆是发生在脑血管基础上的以记忆、认知功能缺损为主,或伴有语言、视空间技能及情感或人格障碍的获得性智能持续性损害的综合征。血管性痴呆产生原因多为脑梗塞导致脑缺血-再灌注引起的脑实质损伤。当今研究表明：兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤和神经细胞凋亡是缺血-再灌注导致的脑实质损伤进而引起血管性痴呆的主要分子生物学机制。川芎嗪是中药川芎的主要有效成分之一,具有清除氧自由基、钙拮抗、扩血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用,广泛应用于临床治疗。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化,生成极性和水溶性较大的代谢物而迅速被排出体外,所以川芎嗪存在半衰期短,生物利用度低等缺点。本课题选用的化合物CXC137,是以氟桂利嗪的主要药效基团二苯甲基-1-哌嗪基甲基基团取代川芎嗪的药代基团2位甲基而合成出的新型川芎嗪烃基哌嗪类衍生物。氟桂利嗪为第2代哌嗪类钙拮抗药,能通过血脑屏障,选择性扩张血管,预防缺血、缺氧引起的细胞内Ca2+超载所致细胞损害,临床上广泛用于心脑血管疾病和外周血管功能不全的防治。以氟桂利嗪的活性基团取代川芎嗪分子的药代基团,以期克服川芎嗪体内半衰期短、生物利用度低等缺点,并通过协同作用增强药效,提高抗心脑血管疾病作用。本研究第一部分以N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)作用于人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),模拟体内兴奋性氨基酸毒性造成的神经细胞损伤,第二部分采用双侧颈总动脉结扎并降压的方法制作大鼠血管性痴呆模型。实验目的为从不同方面探讨CXC137对NMDA诱导的神经细胞损伤和抗凋亡的作用机制,以及对血管性痴呆模型大鼠的药理学作用,为进一步开发该化合物治疗神经系统疾病提供理论基础。同时,以传统中药的有效成分为先导化合物,在构效关系研究的基础上对其进行结构改造和优化,为充分利用我国丰富的天然植物资源进行创新药物研究提供依据。 ***137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞活力的影响采用MTT法检测细胞活力。实验结果显示：SH-SYSY细胞经NMDA200μmol／L损伤后,细胞活力明显降低(P<0.01)。而溶媒组(3%oDMSO)对细胞活力无影响。同时发现,NMDA损伤前或损伤后给予CXC137均对细胞损伤具有保护作用(P<0.01)。 ***137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞LDH释放率的影响收集氧化损伤处理后的细胞培养上清液和细胞裂解液,参照试剂盒说明分别测定培养上清液和细胞裂解液中的LDH活性,计算细胞LDH释放率。实验结果表明：NMDA损伤后SH-SY5Y细胞LDH释放率显著增高(P<0.01)。与模型组相比,CXC137处理后可明显降低细胞LDH释放率(P<0.01)。 3.流式细胞术检测细胞凋亡率细胞经处理后,以Annexin V-FITC／PI双染后上流式细胞仪检测。实验结果表明,与正常组比较,模型组细胞的凋亡率明显升高(P<0.01)。与模型组比较,CXC137各浓度组细胞的凋亡率明显降低,且呈剂量依赖性关系,差异有显著统计学意义(P<0.01)。 ***137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内Caspase-3蛋白活性及表达的影响使用Caspase-3活力检测试剂盒和Western Blot检测Caspase-3活力和表达。实验结果表明：加入NMDA后,Caspase-3蛋白活性及表达均明显升高(P<0.01),CXC13720、40和80μmol／L三个剂量组均可显著降低Caspase-3活力和蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。 ***137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞内游离钙浓度的影响细胞悬液以荧光探针Fura-3／AM负载后,置多功能酶标仪检测荧光强度,检测波长为λem=490 nm/λex=526nm。实验结果表明：加入NMDA损伤后细胞内钙离子浓度升高(P<0.01)。给予20、40、80μmol／L CXC137后,细胞内钙离子浓度均显著降低(P<0.01)。 ***137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞ATP含量的影响收集细胞裂解液,用考马斯亮蓝法定细胞内总蛋白量。按ATP含量检测试剂盒说明书测定细胞ATP含量。实验结果表明：加入NMDA后,细胞内ATP含量明显降低(P<0.01)。给予20、40、80μmol／L CXC137后,ATP含量显著升高(P<0.01)。 ****法测定CXC137体外清除自由基能力将不同浓度的抗氧化剂加入DPPH*后,在516nm处的紫外吸光度会发生改变,用以检测化合物清除自由基的能力。实验结果表明：50mg／ml CXC137体外自由基清除率在40%左右,具有一定的清除自由基的能力。但清除能力不如维生素E和TMP。 ***137对NMDA损伤SH-SY5Y细胞MDA、GSH含量,SOD活力的影响收集细胞

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