检索结果-南通市图书馆

作者：王秀玲山东农业大学

学位级别：硕士

植物在其生长发育的整个生命周期中,会遭遇干旱、涝害、低温、高温、病原菌侵袭、机械损伤等各种不利的环境条件。这些胁迫通过一系列的信号分子被感知和传导,并最终启动不同类型的蛋白如转录因子、酶、分子伴侣和离子通道等的合成或改... 详细信息

植物在其生长发育的整个生命周期中,会遭遇干旱、涝害、低温、高温、病原菌侵袭、机械损伤等各种不利的环境条件。这些胁迫通过一系列的信号分子被感知和传导,并最终启动不同类型的蛋白如转录因子、酶、分子伴侣和离子通道等的合成或改变它们的活性来影响胁迫诱导的基因的调节。在上述蛋白中,转录因子通过调节特定靶基因的表达在激活胁迫响应中发挥着重要的作用,它们对植物的正常生长发育和生理及环境的刺激的响应也是必须的。WRKY蛋白是一类含有锌指结构的转录因子,在所有的高等植物中都由一大类基因家族编码。目前许多研究表明,WRKY转录因子在许多生理过程中发挥着重要的作用。虽然对WRKY转录因子已经有大量的研究,但是多集中在拟南芥等模式生物中,而且不同植物的同源基因或者相同植物的同一家族的不同基因其生物学功能都会有一定的差异。此外,目前关于WRKY转录因子的研究主要揭示了WRKY转录因子的各种功能,而对WRKY转录因子的作用机制和其是否参与多种胁迫的互作并不清楚。棉花作为世界范围内的经济作物之一,同时也是重要的纤维和油料来源,了解棉花中WRKY转录因子的功能具有重要的理论意义和应用价值。本研究以鲁棉22为实验材料,克隆得到了WRKY基因家族的一个成员,命名为GhWRKY40,并对其表达模式和功能进行了分析：(1)进化树分析表明,同源克隆所获得基因是WRKY Ⅱa亚族基因。亚细胞定位分析表明该基因定位在细胞核内,因此推测其可能在细胞核中发挥相应的生物学功能。转录活性分析表明该基因具有转录激活活性。(2)利用qPCR分析GhWRKY40在棉花中的表达模式表明,GhWRKY40的转录水平受伤等非生物胁迫和生物胁迫青枯雷尔氏细菌及多种信号分子水杨酸(SA)、乙烯(ET)、茉莉酸(JA)和过氧化氢(H2O2)等的诱导,说明该基因可能参与多种信号通路。为了进一步证明上述实验结果,采用反向PCR的方法克隆得到GhWRKY40的部分启动子序列,经过PlantCARE和PLACE软件,预测得到一系列与环境胁迫应答和生长发育相关的顺式作用元件。由此得出,GhWRKY40可能参与与这些元件相关的功能的应答。(3)构建GhWRKY40的过表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法获得转基因本生烟植株。GhWRKY40过表达植株较野生型植株表现出对伤胁迫的抗性,而GhWRKY40过表达植株对生物胁迫青枯细菌的侵染却表现出敏感性。qPCR结果表明,在伤和青枯细菌处理后,转基因植株中的JA响应相关基因JAZ1、JAZ3与SA响应相关基因PR1a、PR2和PR4的表达量较野生型植株均有所降低。由此表明GhWRKY40可能参与SA/JA信号途径,并且对伤胁迫和青枯细菌侵染的响应具有协同作用。(4)酵母双杂交实验结果表明GhWRKY40能够与GhMPK20互作。双分子荧光互补实验进一步证实了GhWRKY40能够与GhMPK20互作,并且它们的互作发生在细胞核内。因此,GhMPK20是GhWRKY40的激活基因。

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心叶烟交替氧化酶基因（NgAOX1α）的分离及其表达特性分析

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作者：王健山东农业大学

学位级别：硕士

植物线粒体区别于动物线粒体的重要特征之一是植物线粒体具有一条对氰化物不敏感的电子传递途径,即抗氰呼吸途径(cyanide-resistant respiration pathway)或称对氰化物不敏感的交替氧化途径(cyanide-insensitive alternative pathway, ... 详细信息

植物线粒体区别于动物线粒体的重要特征之一是植物线粒体具有一条对氰化物不敏感的电子传递途径,即抗氰呼吸途径(cyanide-resistant respiration pathway)或称对氰化物不敏感的交替氧化途径(cyanide-insensitive alternative pathway, AP)。电子流通过细胞色素途径,偶联ATP的生成,而电子在细胞色素途径的泛醌处分支,转入交替氧化途径,结合氧气,生成水。该过程并不生成ATP,而是释放热量,由交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)所介导。AOX是交替氧化途径的末端氧化酶,位于线粒体的内膜上。在已检测的物种中,大部分植物组织中都含有AOX蛋白。关于交替氧化途径和AOX的生物学功能一直是植物生理学领域中研究的热门课题,除在一些植物(如天南星科植物)开花过程中产热(有利于传粉)外,AOX蛋白的三级结构及很多生物学功能都不是很清楚。本研究从心叶烟中克隆了交替氧化酶基因(NgAOX1a),对其进行了序列比对、表达特性分析。同时,还克隆了NgAOX1a基因的启动子,构建了缺失分析的表达载体,为下一步分析启动子元件奠定了基础。具体结果如下:1、利用反转录-PCR(RT-PCR)从心叶烟(Nicotiana glutinosa)中分离得到一个AOX基因,即NgAOX1a,GenBank注册号为EF523518。该基因cDNA全长1448bp,包括一个1062 bp的开放阅读框(ORF),124 bp的5′非编码区(untranslated region, UTR)和262 bp的3′UTR。ORF编码一个353氨基酸的多肽,包括2个保守的半胱氨酸残基、4个Fe结合位点、5个α-螺旋区和6个保守的组氨酸残基。序列分析发现NgAOX1a与其他物种中的AOX1基因有较高的同源性。NgAOX1a的基因组含有4个外显子和3个内含子,Southern杂交显示NgAOX1a基因为单拷贝基因。2、Northern杂交分析显示NgAOX1a基因可以被各种非生物胁迫条件强烈诱导,如响应防御反应的外源信号分子水杨酸(salicylic acid, SA)和H2O2、外源的三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环中间代谢物柠檬酸盐,但被乙烯(ethylene, ET)的抑制剂CoCl2抑制表达。此外,NgAOX1a基因还可以被烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)强烈诱导。根据这些结果,可以推测NgAOX1a可能参与多个信号传导途径,并在防御反应中起一定的作用。3、用NgAOX1a构建正义植物表达载体pBI121-NgAOX1a,采用农杆菌介导的方法,转化烟草(NC89),经卡那霉素筛选获得若干转基因植株。以转空载体的植株作为对照。经过PCR鉴定及半定量RT-PCR分析,证明NgAOX1a在转基因烟草中得到成功表达。4、选取T0代转基因株系的自交种子扩繁,得到T1代转基因植株。在分子鉴定的基础上,初步证明所测试的正义转基因株系在T1代中的遗传基本符合3:1的分离规律。5、通过LA PCR和反向PCR的方法获得NgAOX1基因的启动子序列,GenBank注册号为GQ199607。利用分析软件PlantCARE对其进行分析,发现该序列除了存在典型的TATA box和CAAT box外,还存在SA响应元件、光响应元件、真菌响应元件、胁迫响应元件等一系列可能的诱导调控元件。6、用NgAOX1a的启动子序列进行缺失分析,构建6个正义植物表达载体,采用农杆菌介导的方法,转化拟南芥,经卡那霉素筛选获得部分T0代种子。

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中华蜜蜂AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6基因在氧化应激中的功能分析

中华蜜蜂AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6基因在氧化应激中的功能分...

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作者：孟洁山东农业大学

学位级别：硕士

中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是我国特有的授粉昆虫,具有重要的社会价值和生态价值。但近年来,环境问题使中华蜜蜂的生存受到严重影响。重金属、极端温度、紫外线（UV）辐射以及各种农药等环境胁迫因子会对中华蜜蜂造成氧化损伤,因... 详细信息

中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是我国特有的授粉昆虫,具有重要的社会价值和生态价值。但近年来,环境问题使中华蜜蜂的生存受到严重影响。重金属、极端温度、紫外线（UV）辐射以及各种农药等环境胁迫因子会对中华蜜蜂造成氧化损伤,因此对中华蜜蜂抗氧化基因的研究十分必要。蛋白二硫键异构酶（Protein disulfide isomerase,PDI）家族具有许多生物学功能,包括调节细胞凋亡,参与免疫反应,调节癌细胞的增殖和侵染,同时在响应氧化应激的过程中也起到一定作用。本研究从中华蜜蜂中分离得到AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6基因,并对它们进行了生物信息学、表达特性和功能分析,主要结果如下:（1）从中华蜜蜂中分离得到AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6,生物信息学分析表明AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6分别与意大利蜜蜂（Apis mellifera）的PDIA1、PDIA3和PDIA6同源性较高,进化关系更近。AccPDIA1、AccPDIA3都具有四个类似硫氧还原蛋白的结构域:a-b-b’-a’,AccPDIA6具有三个类似硫氧还原蛋白的结构域:a’-a-b。（2）利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）方法对中华蜜蜂AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6基因在成年蜜蜂不同组织部位的表达特性进行了研究,结果表明AccPDIA1在中肠、翅和头表达水平较高,AccPDIA3在足和头中表达水平较高,AccPDIA6在表皮表达水平最高。（3）采用qRT-PCR方法对AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6在多种非生物胁迫条件下的表达特性进行了分析,结果表明以上三个基因受过氧化氢、UV、极端温度、多种农药等胁迫条件的诱导表达,说明以上三个基因参与氧化应激的过程。（4）在大肠杆菌中过表达AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6蛋白,结果表明重组大肠杆菌对过氧化氢和高温和叔丁基过氧化氢（tert-Butyl hydroperoxide,t-BHP）胁迫的抗性增强,说明AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6能够帮助大肠杆菌抵御过氧化氢、高温和t-BHP造成的氧化损伤。利用定点突变方法将AccPDIA6的CXXC基序的半胱氨酸残基突变为丙氨酸残基后,大肠杆菌氧化胁迫的耐受性下降,说明CXXC基序的半胱氨酸残基对AccPDIA6的催化活性有重要作用。（5）将AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6分别沉默后,检测发现一些相关抗氧化基因的表达水平发生变化,抗氧化酶（CAT、POD和CAT）的酶活性也有所改变,并且中华蜜蜂在高温胁迫下存活率下降,说明AccPDIA1、AccPDIA3和AccPDIA6在中华蜜蜂抵抗氧化胁迫过程中发挥重要作用。

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中华蜜蜂细胞色素单加氧酶基因AccCYP6k1在代谢解毒中的功能研究

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作者：谭帅山东农业大学

学位级别：硕士

中华蜜蜂(Apis cerana cerana)简称中蜂,作为自然界中重要的传粉昆虫,在维持全球生物多样性、为农作物提供授粉服务等方面发挥着重要的作用。近年来世界各地的蜜蜂数量急剧下降,其中有毒物质(农药、金属离子)的积累是造成这种现象的主... 详细信息

中华蜜蜂(Apis cerana cerana)简称中蜂,作为自然界中重要的传粉昆虫,在维持全球生物多样性、为农作物提供授粉服务等方面发挥着重要的作用。近年来世界各地的蜜蜂数量急剧下降,其中有毒物质(农药、金属离子)的积累是造成这种现象的主要原因之一。因此筛选中华蜜蜂参与代谢解毒过程的关键基因并解析这些基因的作用机制,对于选育中华蜜蜂优良新品种、提高蜜蜂对农药的耐药性以及促进蜜蜂产业的健康发展具有重要的意义。昆虫细胞色素P450单加氧酶(P450s或CYPs)在内源性和外源性底物的代谢解毒中发挥着重要作用,然而在蜜蜂中P450s的作用机制尚不清楚。本研究从中华蜜蜂中分离得到了一个细胞色素单加氧酶基因AccCYP6k1,在此基础上通过生物化学和分子生物学技术对其生物学功能进行了较为系统的研究,并解析了AccCYP6k1基因在中华蜜蜂代谢解毒中的作用机制,其主要研究结果如下:(1)生物信息学分析结果表明,AccCYP6k1基因与意大利蜜蜂以及大蜜蜂中的Am CYP6k1基因和Ad CYP6k1-like基因的亲缘关系最近。AccCYP6k1蛋白序列含有昆虫细胞色素P450家族所特有的结构域和活性位点,例如C-helix基序、K-helix基序以及heme-binding基序,表明此蛋白在进化上的保守性和功能的专一性。(2)通过反转录定量PCR(RT-qPCR)对AccCYP6k1基因的时空表达模式进行分析。结果显示,AccCYP6k1基因主要在中华蜜蜂的腿部、中肠、头部以及表皮中表达,并且在发育过程中的幼虫期以及成虫期尤其是成年工蜂中表达,这可能与不同日龄的中华蜜蜂所处的环境条件有关,成年期蜜蜂尤其是外出觅食的工蜂更容易接触到农药等有害物质。(3)分析AccCYP6k1基因在不同农药胁迫下的表达特性发现,高效氯氰菊酯、阿维菌素和吡虫啉处理下,AccCYP6k1基因被不同程度的诱导表达,而吡氟甲禾灵、百草枯以及草甘膦异丙胺盐三种农药则抑制AccCYP6k1基因的表达。(4)我们通过RNAi技术对中华蜜蜂体内的AccCYP6k1基因进行敲降,结果发现沉默AccCYP6k1基因增加了中华蜜蜂对阿维菌素和吡虫啉这两种杀虫剂的敏感性,在这两种农药处理下的死亡率明显升高,然而对除草剂草甘膦异丙胺盐的敏感性却没有明显的变化,这可能与AccCYP6k1基因对底物的特异性有关。(5)抑菌实验结果发现,与对照组相比,表达重组AccCYP6k1质粒的大肠杆菌在培养基上的抑菌区域明显变小。该结果表明,在大肠杆菌中过表达重组的AccCYP6k1蛋白可以增加大肠杆菌抵抗外界环境胁迫的能力。(6)沉默AccCYP6k1基因后,中华蜜蜂体内参与解毒和氧化代谢相关基因的表达量明显下调,中华蜜蜂体内关键的解毒酶和抗氧化酶的活性也显著降低。这些结果表明沉默AccCYP6k1基因不仅影响了中华蜜蜂的解毒系统,还可能影响了中华蜜蜂的抗氧化能力,导致其对外界胁迫更加敏感。综上所述,本研究表明AccCYP6k1基因在中华蜜蜂的代谢解毒中发挥着重要的作用。沉默AccCYP6k1基因影响了中华蜜蜂的解毒系统,造成体内的氧化损伤积累,增加了中华蜜蜂对农药的敏感性。此外,AccCYP6k1基因的上调表达与农药的抗性密切相关,并且在体外过表达AccCYP6k1蛋白可以增加宿主对环境胁迫的耐受能力。

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棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMPK11的分离及生物学功能分析

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作者：王芳山东农业大学

学位级别：硕士

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是真核生物中普遍存在的一类苏氨酸/酪氨酸双重特异性蛋白激酶,位于MAPK级联信号途径的最下游,可以直接作用于下游靶基因,引起体内的生理生化变化。MAPK级联信号途径广泛... 详细信息

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是真核生物中普遍存在的一类苏氨酸/酪氨酸双重特异性蛋白激酶,位于MAPK级联信号途径的最下游,可以直接作用于下游靶基因,引起体内的生理生化变化。MAPK级联信号途径广泛参与植物的生长发育、非生物胁迫响应(干旱、高盐、低温等)以及生物胁迫响应(病虫害)等,因此研究MAPK在逆境胁迫下的功能对植物适应逆境胁迫有重要意义。但是目前对MAPK的研究仍然主要集中在模式植物,在农作物中的研究较少。而且对MAPK基因的研究主要集中在MPK3、MPK4和MPK6,其他基因研究较少。棉花是我国重要的经济作物,对棉花中MAPK基因抗逆功能的研究,有助于帮助棉花更好地适应逆境胁迫,具有重要的经济价值和社会效益。本文以陆地棉为研究材料,分离克隆到一个新的基因GhMPK11,并对其进行生物信息学分析和功能分析,具体结果如下:(1)GhMPK11的cDNA序列全长为1274bp,包含136bp的5'非编码区、1098bp的开放阅读框(ORF)和40bp的3'非编码区。ORF编码一个含有365个氨基酸的多肽,预测其分子量约为42kDa,pI值为6.44。基因组结构比较、氨基酸同源比对以及系统发育树分析表明GhMPK11基因属于B组的MAPK,另外利用基因枪法和农杆菌介导的瞬时转化法确定GhMPK11定位在细胞核中。(2)对GhMPK11基因的表达特性进行研究,结果发现过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、植物激素脱落酸(abscissic acid,ABA)、赤霉素(gibberellic acid,GA)、青枯病菌和立氏丝核真菌可以不同程度地诱导GhMPK11的表达。因此我们初步推测GhMPK11参与信号分子途径和植物对病原菌的响应。(3)GhMPK11启动子序列分析发现一些抗性相关元件、生长发育相关元件和GA相关元件等。GUS染色实验结果表明,GA3可以增强转启动子拟南芥植株的GUS活性,进一步说明GhMPK11参与GA信号转导途径。(4)采用农杆菌介导的叶盘法转化本生烟,获得了超表达GhMPK11的烟草植株和转空载体的烟草植株(对照植株)并对它们进行PCR鉴定。观察再生植株的生长过程发现,超表达GhMPK11的烟草植株叶片存在失绿的现象;而且GhMPK11的转基因植株中含有较高的GA3含量和较高的GA相关基因表达量,说明GhMPK11可以通过调节GA相关基因的表达改变GA3含量。(5)转基因植株的抗病性实验说明,超表达GhMPK11可以降低转基因植株对青枯病菌和立氏丝核真菌的抗性,增强感病叶片中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累,这意味着GhMPK11参与调节体内ROS的变化以及生物胁迫响应。(6)分析感病前后叶片中GA、水杨酸(salicylic acid,SA)以及茉莉酸(jasmonic acid,JA)相关基因的表达,发现病原菌处理后GA相关基因的表达存在显著性差异变化,初步断定GhMPK11通过GA信号途径参与植物对病原菌的响应。(7)病原菌侵染离体叶片的同时进行外施GA3处理,结果表明外源GA3可以抵消内源GA3对植株抗病性的影响并增强植株对病原菌的敏感性。结合之前的结果,说明GhMPK11通过GA信号途径来调节抗病反应。(8)测定病原菌处理后ROS相关基因的表达和抗氧化酶的酶活,发现与对照植株相比,超表达GhMPK11的烟草植株中呼吸暴发氧化酶基因(respiratory burst oxidase homolog,RbohB)表达水平较高、抗氧化酶基因表达水平较低、抗氧化酶的酶活较低,说明GhMPK11通过调控ROS相关基因的表达来调节体内ROS的平衡。

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棉花GhWRKY17转录因子参与ABA信号途径及干旱、高盐胁迫反应

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作者：闫慧茹山东农业大学

学位级别：硕士

植物在生长发育过程中经常遭受各种逆境胁迫（如干旱、高盐、营养缺乏、机械损伤、高温、低温及病原菌入侵等）的影响。其中，干旱和高盐胁迫是制约植物生长发育及作物产量的两大重要因素。经过长期的进化，植物形成了一系列机制来适应... 详细信息

植物在生长发育过程中经常遭受各种逆境胁迫（如干旱、高盐、营养缺乏、机械损伤、高温、低温及病原菌入侵等）的影响。其中，干旱和高盐胁迫是制约植物生长发育及作物产量的两大重要因素。经过长期的进化，植物形成了一系列机制来适应和防御各种逆境胁迫。信号转导和基因表达的转录水平调控在植物的抗逆过程中起着重要作用。转录因子（DREB、NAC、WRKY、MYB）是植物中最重要的一类调节基因。WRKY转录因子是近年来发现的一类在植物中广泛存在的重要转录因子超家族。WRKY蛋白通过特异性识别下游目的基因启动子区的W-box，从而参与植物的生长发育及抗逆反应过程。大量研究表明WRKY转录因子在响应植物的生物胁迫反应过程中发挥重要作用。近年来有关WRKY转录因子参与植物非生物胁迫的研究逐渐被报道，但关于WRKY参与非生物胁迫的分子机制仍不是很清楚，对重要经济作物等非模式植物的研究则更少。本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum L.,鲁棉22）为材料，通过同源克隆的方法分离得到一个WRKY家族基因，命名为GhWRKY17，并对其进行了生物学功能分析。具体结果如下：（1）序列分析表明，该基因的cDNA全长1104bp，包括957bp的开放阅读框，编码318个氨基酸的多肽，预测分子量为34.773kDa，pI值为9.87。WRKY蛋白进化保守，该基因含有一个典型的WRKY结构域和锌指结构，并含有Ⅱ类d族的特征结构。进化树分析表明该基因属于Ⅱ类d族WRKY转录因子，因其与拟南芥WRKY17相似性较高，由此命名为GhWRKY17。基因组结构分析表明GhWRKY17含有两个内含子，在棉花基因组中以单拷贝形式存在。（2）利用反向PCR的方法扩增出该基因1163bp的启动子序列。PlantCARE在线软件预测发现，该序列存在一系列参与植物生长发育、应答生物胁迫和非生物胁迫的顺式作用元件。（3）GhWRKY17定位在细胞核中。酵母单杂交实验和农杆菌介导的瞬时表达研究表明，GhWRKY17能够特异性结合W-box并激活下游GUS基因的表达。以上实验结果证实了GhWRKY17具备转录因子的特性。（4）半定量RT-PCR分析发现GhWRKY17的表达不仅受非生物胁迫如干旱、高盐、机械损伤、低温的诱导，还能被ABA和H2O2等信号分子诱导。（5）GhWRKY17超表达植株对干旱和盐胁迫敏感。在种子萌发期对干旱和盐的敏感症状在施加ABA合成抑制剂时消失，说明GhWRKY17负调控干旱、盐胁迫的反应过程与ABA有关。（6）GhWRKY17超表达植株在种子萌发期和萌发后的生长对ABA敏感，但对ABA调控的气孔关闭不敏感，导致较高的失水率从而对干旱敏感，表明GhWRKY17通过ABA信号途径参与植物的干旱胁迫反应。（7）在干旱、高盐胁迫下，超表达植株的叶片积累了较多的ROS，氧化损伤较为严重，SOD、POD、CAT和APX酶活性和脯氨酸降低，说明GhWRKY17可能通过调节ROS水平参与植物的干旱、盐胁迫反应。（8）GhWRKY17超表达植株对氧化胁迫敏感。

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转NtAOX1a基因烟草的获得及其抗逆性分析

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作者：张毅山东农业大学

学位级别：硕士

高等植物线粒体电子传递链主要有两条,一条是对氰化物敏感的细胞色素途径,另一条是抗氰化物的交替氧化途径,后者由位于线粒体内膜上的交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)所催化。AOX由一个小的核基因家族所编码。AOX基因和AOX蛋白的... 详细信息

高等植物线粒体电子传递链主要有两条,一条是对氰化物敏感的细胞色素途径,另一条是抗氰化物的交替氧化途径,后者由位于线粒体内膜上的交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)所催化。AOX由一个小的核基因家族所编码。AOX基因和AOX蛋白的表达受到多种生物和非生物胁迫的诱导。研究表明,AOX在维持各种条件下植物体内的动态平衡以及保护植物免受活性氧(ROS)的伤害中起到非常重要的作用。AOX能对低温做出响应,而且参与植物的抗病毒过程。但是,AOX是否会影响低温和病毒侵染时的ROS积累,以及AOX是否还有别的生物学功能仍然知之甚少。本研究从三生烟草中克隆了交替氧化酶基因(NtAOX1a),构建含NtAOX1a基因的2种植物表达载体,通过农杆菌介导转化三生烟草,获得了含不同NtAOX1a表达水平的转基因植株,并对这些转基因株系的T3代植株进行了生物学功能分析。具体结果如下: 1、根据已报道的AOX1基因核苷酸序列,设计特异引物,采用RT-PCR的方法,从三生烟草中克隆了交替氧化酶基因(NtAOX1a),cDNA全长为1071bp。 2、构建2种植物表达载体,即含正义NtAOX1a的载体pBI-S- NtAOX1a,含反义NtAOX1a的载体pBI-AS-NtAOX1a。通过农杆菌介导将2种载体分别转化三生烟草,同时转化pBI121空载体作为对照,从而获得3种不同基因型的转基因三生烟草植株。 3、对不同基因型转基因烟草当代(T代)所结的种子,经卡那霉素筛选,并结合转基因株系的T代植株PCR鉴定结果,初步证明在被检验的转基因株系中,转基因在T代中的遗传基本符合3:1的分离规律。 4、筛选符合3:1分离规律的T代植株,分别进行Northern杂交和Western杂交分析,表明在T代转基因烟草中,NtAOX1a已经成功表达。 5、在T代转基因烟草中选出有代表性的株系繁殖至T代,Northern杂交和Western杂交分析验证NtAOX1a在T代株系中稳定表达;然后对T代植株进行呼吸测定,结果表明AOX途径呼吸速率随NtAOX1a表达水平的改变而改变。 6、在分子鉴定的基础上,对T代转基因植株进行了生物学功能分析。低温胁迫下,转正义NtAOX1a的株系清除过氧化氢(HO)的能力较野生型显著提高,受到ROS的伤害也较小;接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)后,与野生型相比,转反义NtAOX1a的株系具有明显的抗病性,而且AOX在抗病中的功能似乎与其对HO的清除作用有关;种子萌发实验表明,当细胞色素途径被抑制后,AOX过量表达能够显著提高种子对HO的抗性,表明AOX在植物的早期发育阶段也起到一定作用。

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棉花促丝裂原活化蛋白激酶基因GhMPK6a和GhMPK20的生物学功能分析

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作者：李玉真山东农业大学

学位级别：硕士

在植物长期进化过程中，MAPK信号级联途径（Mitogen-activated protein kinasepathway）在将细胞外信号刺激转导至细胞内从而引起相应的生理生化反应的过程中起着重要的枢纽作用。目前许多研究表明，MAPK级联信号途径广泛参与干旱、高... 详细信息

在植物长期进化过程中，MAPK信号级联途径（Mitogen-activated protein kinasepathway）在将细胞外信号刺激转导至细胞内从而引起相应的生理生化反应的过程中起着重要的枢纽作用。目前许多研究表明，MAPK级联信号途径广泛参与干旱、高盐等多种非生物胁迫及病原体侵染等生物胁迫信号途径，但目前大多数研究集中于拟南芥等模式生物中，对于经济作物棉花中的研究较少。另外，不同植物中的同源基因或者相同植物中同一家族的不同基因其生物学功能也具有一定的差异性。所以，借鉴已有的模式植物中相关同源基因的生物学功能研究，进而对重要的经济作物中相关基因的研究具有一定的必要性。棉花是世界性的纤维及油料作物，在我国是除粮食以外的重要经济作物之一，具有重要的经济价值。本研究以陆地棉（Gossypium hirsutum L.）（鲁棉22）为研究材料，利用同源克隆的方法克隆获得两个MAPK基因，对其分别进行了序列分析、表达模式分析及生物学功能鉴定等，研究结果如下：（1）通过同源克隆的方法获得两个MAPK基因。通过基因全序列测定及进化树分析表明，同源克隆所获得基因分别为MAPK A亚组和D亚组基因，依据基因同源性将两基因分别命名为GhMPK6a和GhMPK20。亚细胞定位分析表明两者均定位于细胞质和细胞核中。因此推测两者可能在细胞质和细胞核中发挥相应的生物学功能。（2）对GhMPK6a和GhMPK20在棉花中的表达模式进行研究表明，GhMPK6a和GhMPK20的转录水平可受高盐、机械损伤、干旱和冷等非生物胁迫;脱落酸（Abacissicacid, ABA）、乙烯（Ethylene, ET）、茉莉酸（Jasmonate, JA）等多种信号分子及青枯细菌的诱导，说明两基因可能分别参与多种信号通路。（3）分别构建了两基因的正义植物表达载体，并通过农杆菌侵染的方法获得GhMPK6a和GhMPK20转基因本生烟植株，对两者的转基因本生烟植株进行生物学分析表明，转基因植株均对非生物胁迫干旱和高盐的敏感性增强。另外，GhMPK6a转基因植株对生物胁迫青枯细菌的侵染也表现一定的敏感性。通过IR-PCR的方法分别获得GhMPK6a和GhMPK20的启动子序列后，通过软件分析及GUS活性分析表明GhMPK6a与生长发育具有一定的相关性。GhMPK20的启动子序列分析及过表达GhMPK20的转基因植株的生长表型表明GhMPK20也与生长发育有关。（4）通过酵母双杂交的方法，证实所获得GhMKK4能够与GhMPK6a和GhMPK20互作。另外，通过双分子荧光互补实验进一步证实GhMKK4能够与GhMPK6a和GhMPK20在细胞质和细胞核中互作，说明GhMKK4为GhMPK6a和GhMPK20的上游激活基因。

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棉花促丝裂原活化蛋白激酶（GhMAPK）基因的分离与功能分析

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作者：王玫玫山东农业大学

学位级别：硕士

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。MAPK级联途径(MAPKKK-MAPKK-MAPK)通过依次磷酸化传递环境信号,参与植物生长发育和多种生物、非生物胁迫... 详细信息

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶。MAPK级联途径(MAPKKK-MAPKK-MAPK)通过依次磷酸化传递环境信号,参与植物生长发育和多种生物、非生物胁迫信号转导。近年来许多研究发现MAPK与植物病原信号传递关系相当密切,并鉴定多种受病原侵染诱导的MAPK。棉花是一种重要的经济作物,利用基因工程方法培育棉花抗病新品种已经成为棉花育种的研究热点。本文以鲁棉22为材料,首次从棉花中克隆了MAPK基因(GhMAPK),并对其进行了序列比对,表达特性分析及功能鉴定。具体结果如下: 1.根据同源序列设计简并引物,通过RT-PCR和RACE-PCR的方法从棉花(Gossypium hirsutum)中克隆到一个MAPK基因,命名为GhMAPK。GenBank注册号为DQ132852。其cDNA全长为1832bp,编码一个372氨基酸蛋白质。序列分析发现GhMAPK具有蛋白激酶所保守的11个亚区和TEY特征磷酸化位点。与C组MAPK同源性最高,同来自于拟南芥、杏、矮牵牛、豌豆、烟草中的几种MAPK同源性高达83-89%。cDNA序列与基因组序列比较后发现GhMAPK基因组序列内存在两个内含子。 ***杂交说明在棉花基因组中可能存在多个与GhMAPK具有一定同源性的其他MAPK基因,或者可以说存在一个小的MAPK基因家族。Northern杂交发现GhMAPK转录水平受机械损伤,高盐,冷害等非生物胁迫诱导而提高;植物抗病反应相关信号分子SA和H2O2也能诱导GhMAPK表达;棉花幼苗接种棉花枯萎病菌后,GhMAPK表达量也有明显提高,进一步证明了GhMAPK参与了病原侵染反应过程。 3.将GhMAPK构建了正义植物表达载体pBI121-GhMAPK,采用农杆菌介导的方法,转化烟草(NC89),同时转空载体为对照。经卡那霉素筛选获得若干再生植株。经过PCR鉴定,并选取部分转基因植株进行了Northern和Western杂交分析,结果证明GhMAPK在转基因烟草中已成功得到表达。 4.选取两个T0代转基因株系的自交种子扩繁,得到T1代转基因植株。在分子鉴定基础上,对T1代转基因植株进行了生物学功能分析。抗真菌实验中,接种了黑胫病原菌(Phytophtora parasitica *** Tucker)的转基因植株的抗病能力明显高于对照植株。烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV)侵染后,ELISA检测的结果表明,转基因植株中有部分株系表现出了明显的抗病性,但数量很少,大部分表现为感病,病毒抗性植株仅占接病总株数的约10%。 5.构建原核表达载体pET- GhMAPK,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达融合蛋白,将特异诱导带切下,溶于PBS中获得抗原,免疫小鼠,其抗血清效价为1﹕1000。

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棉花促分裂原活化蛋白激酶基因GhMPK4的分离及抗病功能分析

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作者：马曼莉山东农业大学

学位级别：硕士

棉花作为我国重要的经济作物,常遭受多种病原菌的侵袭,从而影响棉花的产量和品质问题。其中,棉花枯萎病由棉花枯萎病菌引起,是影响棉花生产的主要病害。为了抵御病害的侵袭,植物在长期的进化过程中形成了一系列的应答机制。促分裂原活... 详细信息

棉花作为我国重要的经济作物,常遭受多种病原菌的侵袭,从而影响棉花的产量和品质问题。其中,棉花枯萎病由棉花枯萎病菌引起,是影响棉花生产的主要病害。为了抵御病害的侵袭,植物在长期的进化过程中形成了一系列的应答机制。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联途径普遍存在于真核生物中,是一类高度保守的信号转导途径,在病原物诱导的抗病反应中发挥着重要的作用。到目前为止,关于MAPK调控棉花对枯萎病抗性的研究鲜有报道。因此,利用分子生物学的方法研究MAPK对棉花枯萎病的调控,对于提高棉花对枯萎病的抗性有着重要的理论及实践意义。在本研究中,我们从陆地棉中分离出一个MAPK基因GhMPK4,通过对其进行表达特性分析和生物学功能分析,初步发现GhMPK4在抵抗棉花枯萎病胁迫过程中发挥着重要作用。具体结果如下:(1)通过PCR的方法获得GhMPK4的编码区序列,其长度为1137bp,编码378个氨基酸多肽,预测蛋白分子量为43.37kDa,等电点为6.6。通过氨基酸序列比对以及进化树分析发现,GhMPK4属于B组MAPK。(2)亚细胞定位实验发现GhMPK4定位于细胞质和细胞核中。说明GhMPK4可能在细胞质和细胞核中发挥作用。(3)棉花枯萎病菌和植物激素抑制了GhMPK4的表达。通过qRT-PCR的方法对GhMPK4进行表达特性分析。结果发现GhMPK4在棉花根、茎和子叶中均有表达;此外,棉花枯萎病菌、水杨酸和茉莉酸均不同程度地抑制GhMPK4的表达。(4)GhMPK4的沉默增强了棉花对枯萎病菌的敏感性。利用病毒介导的基因沉默技术获得了GhMPK4沉默棉花植株。接菌处理后发现,与对照棉花相比,GhMPK4沉默棉花叶片积累了更多的活性氧、造成了严重的损伤,并且抑制了SA和JA介导的相关基因的表达。(5)GhMPK4超表达烟草植株增强了对棉花枯萎病菌的敏感性。利用农杆菌介导的叶盘转化法,筛选得到了3株稳定表达的转基因株系作为实验材料。对其接菌处理后发现,与野生型烟草相比,GhMPK4超表达烟草植株积累了更多的活性氧、造成了严重的损伤,并激活了SA和JA介导的相关基因的表达。(6)组成型激活GhMPK4在棉花叶片中产生类病斑表型。利用定点突变实验,我们获得了不同活性的GhMPK4(无活性的GhMPK4AA和组成型激活的GhMPK4EE)。进一步实验发现,组成型激活的GhMPK4在棉花叶片中积累了大量的活性氧,造成类病斑表型,并促进了SA和JA介导的植物抗病基因的表达。(7)GhMPK4-GhWRKY33级联途径在参与调控棉花对枯萎病抗性过程中发挥着相同的作用。通过酵母双杂交实验筛选出Gh MPK4的下游基因Gh WRKY33。然后利用病毒介导的基因沉默技术,获得了GhWRKY33沉默棉花植株。通过接菌实验发现,GhWRKY33的沉默增强了棉花对枯萎病菌的敏感性。该现象与GhMPK4沉默棉花接菌后的现象一致。

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