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长链非编码RNA-1708抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化的体外研究

长链非编码RNA-1708抑制人骨髓间充质干细胞成骨分化的体外研究

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作者：曹峻川南方医科大学

学位级别：硕士

背景牙周炎、畸形、外伤、肿瘤等原因常常导致颌面部骨组织严重缺损,寻找有效治疗颌面部骨组织缺损的方法一直以来都是颌面外科的研究方向。骨组织工程以其优秀的生物安全性、相容性及材料来源广泛等原因,成为了研究热点。骨组织工程主... 详细信息

背景牙周炎、畸形、外伤、肿瘤等原因常常导致颌面部骨组织严重缺损,寻找有效治疗颌面部骨组织缺损的方法一直以来都是颌面外科的研究方向。骨组织工程以其优秀的生物安全性、相容性及材料来源广泛等原因,成为了研究热点。骨组织工程主要包含3个组成部分,种子细胞、支架材料和生长因子,其中种子细胞是核心。人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）具有优异的体外增殖能力,自我更新能力和种植无免疫排斥反应等优点,是较为理想的种子细胞,研究其成骨分化的机制对促进骨组织工程的发展意义重大。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一种几乎不编码蛋白的RNA,近年来有研究表明lncRNA广泛参与了细胞增殖分化的调控,揭示lncRNA在hBMSCs成骨分化中的调控作用机制,对利用骨组织工程修复颌面部骨缺损有着积极的意义。目的lncRNA-1708是本课题组在前期高通量测序实验中发现的新型lncRNA,本次研究将利用体外诱导hBMSCs成骨分化和实时荧光定量PCR的方法,检测lncRNA-1708在hBMSCs体外成骨分化中的表达差异,并利用转染病毒载体的方式构建能稳定高表达及低表达lncRNA-1708的hBMSCs,诱导其成骨分化,探讨lncRNA-1708在体外环境中对hBMSCs成骨分化的影响。方法***成骨分化培养2周,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色等方式对hBMSCs成骨分化效果进行鉴定。用荧光定量PCR（RT-PCR）检测hBMSCs成骨分化前后lncRNA-1708的相对表达量变化。2.构建lncRNA-1708过表达逆转录病毒组及shlncRNA-1708干扰慢病毒组,分别转染hBMSCs,获得能稳定差异表达lncRNA-1708的hBMSCs。3.诱导转染后的hBMSCs成骨分化2周,RT-PCR检测成骨特异性因子Runt相关转录因子2（RUNX2）、碱性磷酸酶（ALP）mRNA的表达量并行碱性磷酸酶染色及茜素红染色。结果***成骨分化效果明显,与hBMSCs成骨分化前相比,lncRNA-1708表达量在hBMSCs成骨分化后明显降低（P＜0.001）。2.在稳定高表达 lncRNA-1708 和低表达 lncRNA-1708 的 hBMSCs 中 lncRNA-1708 的表达量较其对应的阴性对照相比有明显变化（lncRNA-1708 过表达组,P＜0.05;lncRNA-1708 低表达组,P＜0.01）。3.与阴性对照组相比,过表达lncRNA-1708的hBMSCs中成骨特异性因子RUNX2、ALP表达水平降低（P＜0.01）,碱性磷酸酶染色颜色变浅,茜素红染色钙结节相对减少。在低表达lncRNA-1 708的hBMSCs中的RUNX2、ALP表达水平与其对应的阴性对照组相比明显升高（P＜0.01）,碱性磷酸酶染色加深,茜素红染色钙结节相对增多。结论***-1708在hBMSCs体外成骨分化中表达量降低。***-1708在体外具有抑制hBMSCs成骨分化的作用。

关键词：人骨髓间充质干细胞成骨分化长链非编码 RNA 抑制效应

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应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研究及MIP-3α在人舌鳞状细胞癌组织中的表达及意义

应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研...

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作者：徐丹丹南方医科大学

学位级别：硕士

背景与目的：舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤,约占口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的25%-40%。其恶性程度高、生长快、浸润性强,具有较高的区域性淋巴结转移率和复发率... 详细信息

背景与目的：舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤,约占口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的25%-40%。其恶性程度高、生长快、浸润性强,具有较高的区域性淋巴结转移率和复发率。近几十年来,尽管临床上以手术为主,术前术后的放疗或化疗为辅助的综合治疗已经很普遍,但对舌鳞癌生存率的提高并不明显。手术创伤大,术后常造成患者语言、进食等功能障碍及颜面部的畸形,放化疗产生较多的毒副作用,严重影响患者的生存质量。5年总体生存率仍然徘徊在55%-60%左右,复发和转移仍是影响预后的重要因素。因此,面对如何提高舌癌疗效这一世界难题迫切需要人类不断研究并寻找到更加安全有效的治疗途径。然而肿瘤的复发和转移是个复杂的多因素过程,是由肿瘤细胞的特征,肿瘤微环境的因素以及肿瘤细胞和周围微环境相互影响共同作用的结果。正常的细胞和其周围组织环境之间存在着动态平衡,两者相互作用可以调控细胞活性,决定细胞增殖分化、凋亡以及细胞表面相关分子的分泌和表达。而肿瘤的突变的过程是不断打破这一平衡的恶性循环过程。肿瘤微环境是由肿瘤细胞、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞共同组成的一个复杂的集合系统。间质细胞和癌细胞之间可以相互诱导、相互作用,并产生大量的炎症因子、生长因子、趋化因子以及基质降解酶,有利于肿瘤的增殖、转移、侵袭和抗凋亡。早在1979年,Lord就提出了肿瘤微环境的概念,即指肿瘤在其发生过程中的内环境。在肿瘤微环境中,免疫炎性反应、组织缺氧和酸中毒、间质高压形成、生成大量的生长因子和蛋白水解酶等构成了微环境的生物学特征。这些特征对于肿瘤的增殖、侵袭、迁移、黏附及新生血管、淋巴管的形成具有重要影响,是肿瘤不断恶化并发生转移的重要原因。不难发现,在对肿瘤微环境研究的很多方面都渗透着肿瘤与炎症的联系,肿瘤与炎症的关系已经成为肿瘤研究的新方向,肿瘤炎症微环境的研究已经成为当今肿瘤研究的热点。有学者已将肿瘤的炎症微环境列为继生长信号的自给自足、对生长抑制信号的不敏感、对凋亡的逃逸、无限的复制能力、持续的血管生成能力、组织的侵犯和转移之后癌症的第七大特征。所以针对肿瘤相关炎症的治疗可以转变肿瘤炎症微环境,或者阻止炎症细胞移行到肿瘤灶。它们也可以将促肿瘤微环境调整为抑制肿瘤的微环境,增强特异的获得性免疫反应,抑制转移扩散。然而肿瘤炎症微环境靶点众多,从中挑选出重要的分子靶点是第一步,而弄清微环境中各种炎症因子水平的变化将会是确定靶点的关键。与肿瘤相关的炎症因子在不同类型的肿瘤中表达存在差异,对于特定的组织和特定种类的肿瘤其特异性炎症因子的确定是非常重要的。传统的免疫及组织学技术存在着所需样本量较大,不能同时检测大量抗原抗体指标及反映出致病过程中多种因子的复杂变化的制约因素。本研究想通过一种高通量、高效、精确的方法直接筛选出人舌鳞癌细胞株和正常口腔黏膜上皮细胞之间差异性变化的炎症因子,为进一步探讨差异性炎症因子对肿瘤生物学行为的影响及机制的研究提供前提,为寻找理想的肿瘤炎症微环境的治疗靶点奠定基础。随着人类基因组计划(HGP)顺利实施,以生命活动的执行者——蛋白质为研究对象的蛋白质组学越来越显得重要,并构想和发展了快捷、高效、并行、高通量的蛋白质组检测新技术——蛋白质芯片技术。蛋白质芯片能够同时分析上千种蛋白质的变化情况,使得在全基因组水平研究蛋白质的功能成为可能。抗炎症因子芯片是一种功能性的蛋白芯片,其将与炎症相关的细胞因子集成到一张芯片上,其能同时检测生物样品中与某些疾病或环境因素可能相关的炎症因子含量的变化情况。本研究通过应用蛋白质芯片技术(抗炎症因子芯片)筛选、分析不同侵袭能力的人舌鳞状细胞癌细胞株之间以及其和正常口腔黏膜上皮之间差异性炎症因子的表达及意义。同时结合文献用免疫组化方法检测差异性炎症因子在舌鳞癌组织中的表达情况,并进一步探讨其临床意义。研究内容共分两章：第一章应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研究;第二章MIP-3α在人舌鳞状细胞癌组织中的表达及其相关临床意义。第一章应用蛋白质芯片技术筛选人舌鳞癌细胞株中差异性炎症因子的初步研究1.研究目的：差异性炎症因子的筛选为进一步探讨差异性炎症因子对肿瘤生物学行为的影响及机制的研究提供前提,为寻找理想的肿瘤炎症微环境的治疗靶点奠定基础。2.研究方法：体外培养人舌鳞癌细胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113和人正常口腔黏膜上皮细胞,消化后分别提取胞内、胞外蛋白,上芯片孵育,封闭,清洗。采用激光扫描仪Genpix4000B扫描芯片,用Axon GenePi

关键词：舌鳞状细胞癌蛋白质芯片舌鳞癌细胞株炎症因子免疫组织化学巨噬细胞炎症蛋白-3α

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