检索结果-南通市图书馆

作者：庄园吉林大学

学位级别：硕士

查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是黄酮类化合物合成途径中重要的聚酮合成酶。CHS以三分子丙二酰辅酶A和一分子香豆酰辅酶A为底物，生成查尔酮。查尔酮是合成花青素、黄酮、异黄酮等化合物的前体。CHS除了能影响植物花色，还在植... 详细信息

查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS)是黄酮类化合物合成途径中重要的聚酮合成酶。CHS以三分子丙二酰辅酶A和一分子香豆酰辅酶A为底物，生成查尔酮。查尔酮是合成花青素、黄酮、异黄酮等化合物的前体。CHS除了能影响植物花色，还在植物抗紫外辐射，抗氧化和防御病原菌侵染中发挥重要作用。肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl-CoAreductase，CCR)催化木质素特异途径的第一步反应，即催化对-香豆酰辅酶A、阿魏酰辅酶A和5-羟基-阿魏酰辅酶A分别生成对-香豆醛、松柏醛和5-羟基-松柏醛。CCR基因除了参与木质素单体的生物合成以外，还在植物防御病害，防御紫外辐射中起着重要作用。红松属于松科松属，是东北地区的特有物种之一。研究红松CHS和CCR基因，有助于了解黄酮类化合物和木质素的合成途径。本文从红松中分别克隆了CHS和CCR基因，为进一步研究红松CHS和CCR蛋白的结构及运用基因工程手段改良红松品种，提高红松抗病抗逆性做了铺垫。研究结果如下： 1.以CHS-F、CHS-R为引物进行红松CHS基因的PCR扩增。测序表明红松CHS基因全长为1191bp(GenBank ID: KJ796482)，该基因编码396个氨基酸，理论分子量约为43.37kD，等电点为5.88。以CCR-F、CCR-R为引物进行CCR基因的扩增。测序表明红松CCR基因全长为975bp(GenBank ID: KJ796481)，该基因编码324个氨基酸的蛋白，理论分子量约为35.63kD，等电点为6.19。 ***结果显示，红松CHS基因编码蛋白与拟南芥、辣椒、兔眼蓝莓、毛果杨等物种中的查尔酮合酶表现出高度的一致性，分别为83%、86%、84%、83%。红松CCR基因编码蛋白与柳桉、欧洲云杉、辐射松等物种中的肉桂酰辅酶A还原酶表现出比较高的一致性，分别为77%、93%、100%，与拟南芥、水稻的肉桂酰辅酶A还原酶一致性较低，分别为49%、57%。 3.多序列比对结果表明，与其他高等植物的CHS蛋白氨基酸序列相比，红松CHS蛋白氨基酸序列在进化上具有高度保守性。红松CCR蛋白氨基酸序列与其他高等植物的CCR蛋白氨基酸序列在系统进化上具有保守性。 4.将红松CHS基因和CCR基因的氨基酸序列与其他植物的相应序列用MEGA5.0软件进行多序列比较，并构建系统进化树。结果显示：与红松CHS基因亲缘关系最近的是马尾松和欧洲冷杉。与红松CCR基因亲缘关系最近的是辐射松和欧洲冷杉。红松CCR基因与柳桉、大麻槿、银杏等物种亲缘关系也较近。

关键词：红松查尔酮合酶肉桂酰辅酶A还原酶克隆

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人参种子后熟分子机理的研究

人参种子后熟分子机理的研究

作者：曲庆玲吉林大学

学位级别：硕士

人参（Panax ginseng ***）为五加科多年生草本植物,是名贵的中药材。研究表明,人参在调节人体中枢神经系统、提高免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖等方面都有良好功效,因此被广泛用于药品、保健品、化妆品等各类产品中,具有可观的经济... 详细信息

人参（Panax ginseng ***）为五加科多年生草本植物,是名贵的中药材。研究表明,人参在调节人体中枢神经系统、提高免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖等方面都有良好功效,因此被广泛用于药品、保健品、化妆品等各类产品中,具有可观的经济价值和广阔的应用前景。人参主要通过种子繁殖,人参种子具有后熟特性,需要经历长时间的形态后熟和生理后熟。目前人参种子后熟的分子机制尚不清晰。赤霉素和脱落酸是调控种子休眠和萌发的关键激素,在人参种子后熟过程中,种胚需要依次完成形态后熟和生理后熟才能发芽,WRKY转录因子能通过调控靶基因的表达,调节植物生长发育。本研究对人参种子进行自然层积处理,筛选赤霉素和脱落酸代谢关键基因（GA2ox、GA20ox、NCED、CYP707A）、植物胚胎发育相关基因（SERK、BBM、WUS、FUS3、AGL15、LEC1）和WRKY转录因子（WRKY3、WRKY6、WRKY40）,利用半定量PCR和荧光定量PCR对以上基因在人参种子后熟过程中的表达水平进行检测。本研究结果如下:（1）对新鲜采集的人参种子进行层积处理,每45天取样一次,根据种胚形态和胚率将人参种子后熟过程划分为六个时期,分别为S1-形态后熟早期;S2-形态后熟中期;S3-形态后熟末期;S4-生理后熟早期;S5-生理后熟中期;S6-生理后熟末期。（2）克隆GA和ABA代谢关键基因（GA2ox、GA20ox、NCED、CYP707A）、植物胚胎发育相关基因（SERK、BBM、WUS、FUS3、AGL15、LEC1）和WRKY转录因子（WRKY3、WRKY6、WRKY40）的核心片段,并分别测序。结果显示引物设计和克隆基因长度合理,产物特异性好。（3）以人参5Sr RNA为内参基因,对目的基因进行半定量PCR,根据电泳结果初步判断目的基因在人参种子后熟过程中的表达量。利用实时荧光定量PCR进一步检测基因的表达情况,并分析结果。在人参种子后熟过程中,GA和ABA代谢关键基因:GA2ox基因表达量不断降低,GA20ox基因表达量不断升高;CYP707A基因表达量先降后升,NCED基因表达量不断下降。植物胚胎发育相关基因:基因表达量都表现升高的趋势,只是升高幅度不同。WRKY转录因子:WRKY3基因表达量不断下降,WRKY6基因表达量不断升高,WRKY40基因表达量不断下降。（4）克隆人参GA2ox基因的CDS序列,将其命名为Pg GA2ox,并提交Gen Bank,获得登陆号为KT692958.1。根据测序结果,Pg GA20ox基因的CDS长度为987bp,编码328个氨基酸,与西洋参GA20ox基因氨基酸序列比对相似性为98.78%。（5）克隆人参GA20ox基因的CDS序列,将其命名为Pg GA20ox,并提交Gen Bank,获得登陆号为KX790244.1。根据测序结果,Pg GA20ox基因的CDS长度为1092bp,编码363个氨基酸,与西洋参GA20ox基因氨基酸序列比对相似性为98.90%。（6）克隆人参WRKY3基因的CDS序列,将其命名为Pg WRKY3,并提交Gen Bank,获得登陆号为KX790243.1。根据测序结果,Pg WRKY3基因的CDS长度为1356bp,编码451个氨基酸,与西洋参WRKY3基因氨基酸序列比对相似性为99.33%。本实验通过分析多个植物激素GA、ABA代谢关键基因,植物胚胎发育相关基因和WRKY转录因子的表达情况,为研究人参种子后熟的分子机理奠定基础。

关键词：人参种子形态后熟生理后熟表达分析基因克隆

植物激素和诱导子对人参发根皂苷含量的影响研究

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植物激素和诱导子对人参发根皂苷含量的影响研究

作者：徐立新吉林大学

学位级别：硕士

人参发根是经发根农杆菌A4菌株浸染人参外植体遗传转化而成,属非天然植物。与传统的细胞悬浮培养相比,植物发根具有生长速度快、活性物质含量高和遗传性状稳定等特点。人参发根培养目的之一就是要获得相对含量较高的人参皂苷,实现人参... 详细信息

人参发根是经发根农杆菌A4菌株浸染人参外植体遗传转化而成,属非天然植物。与传统的细胞悬浮培养相比,植物发根具有生长速度快、活性物质含量高和遗传性状稳定等特点。人参发根培养目的之一就是要获得相对含量较高的人参皂苷,实现人参皂苷工厂化生产。随着生物工程的进一步发展,应用代谢工程手段来增加次级代谢产物产量的研究已成为热点。发根中次级代谢产物的产量受营养因子、植物激素、前体物和诱导子等的影响。本文向人参发根中添加了植物激素及诱导子,其目的是调控人参皂苷生物合成途径,提高培养物中人参总皂苷及Rb1的含量。本文对人参发根进行继代和扩大培养,经过四个月的继代和扩大培养,由最初的1瓶固体培养基的人参发根获得了40瓶的固体培养基和52瓶液体培养基的人参发根,取得了后续实验所需的人参发根材料。在MS液体培养基中加入了不同的植物激素(3-吲哚丁酸、萘乙酸和2,4-二氯苯氧乙酸)和诱导子(水杨酸和茉莉酸甲酯)对人参发根进行培养,然后利用索氏提取法对人参发根进行了总皂苷的提取,再经过大孔树脂D101去除多糖,并通过香草醛比色法确定总皂苷的含量,利用高效液相色谱法测定了人参皂苷单体Rb1的含量,通过对比总皂苷及Rb1的含量,最终确定了最优的培养方法,即浓度为0.050mg/L的添加NAA的MS培养基更有利于人参发根中有效物质的积累。本文所研究的茉莉酸甲酯对人参发根的生长、人参发根中总皂苷和Rb1含量的影响,此前未曾报导。其成果可提高培养物中人参发根总皂苷和Rb1的含量,从而降低生产成本。

关键词：人参发根总皂苷人参皂苷Rb1 茉莉酸甲酯高效液相色谱

非生物因素对人参皂苷生物合成途径关键酶基因表达能力的影响

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非生物因素对人参皂苷生物合成途径关键酶基因表达能力的影响

作者：吴思阳吉林大学

学位级别：硕士

人参为五加科多年生草本植物,是一种珍贵的中药材。人参皂苷是人参中主要的次生代谢产物,具有多种药理作用,如提高免疫力、改善疲劳、抗衰老和抗肿瘤等,被广泛应用于医药保健、美容化妆品和食品等行业,因此人参皂苷具有广阔的应用前景... 详细信息

人参为五加科多年生草本植物,是一种珍贵的中药材。人参皂苷是人参中主要的次生代谢产物,具有多种药理作用,如提高免疫力、改善疲劳、抗衰老和抗肿瘤等,被广泛应用于医药保健、美容化妆品和食品等行业,因此人参皂苷具有广阔的应用前景及可观的经济价值。但野生人参资源较为匮乏,栽培周期较长,易受病害侵袭,种植技术要求较高,尤其是人参皂苷的含量较低,因此对人参的开发利用受到一定限制,难以满足社会需求。研究表明,外界刺激因子(如非生物胁迫、外源激素处理等)能够通过激活细胞信号转导通路,将信号传递给胁迫应答转录因子,调节一系列相关关键酶基因的表达,影响次生代谢产物的合成,从而使植物产生胁迫耐受。本研究讨论了在盐胁迫、低温胁迫、外源MeJA和ABA等非生物因素处理下,人参转录因子基因WRKY、ERF、MYB以及人参皂苷生物合成途径中3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶基因(HMGR)、达玛烯二醇合成酶基因(DS)、原人参二醇合成酶基因(D12H)、原人参三醇合成酶基因(P6H)、原人参二醇三羟基一葡萄糖基转移酶基因(UGT-D-3OH-1)、原人参二醇三羟基二葡萄糖基转移酶基因(UGT-D-3OH-2)、原人参二醇二十羟基葡萄糖基转移酶基因(UGT-D-20OH)的表达情况,并分析比较了4种不同处理条件、3个人参转录因子基因、7个人参皂苷生物合成关键酶基因三者之间的关系。进行如下研究:(1)成功克隆得到人参转录因子WRKY1基因的CDS序列,并将其命名为Pg WRKY1。测序结果显示,PgWRKY1基因序列长度为1077 bp,可以编码358个氨基酸。序列比对结果表明,PgWRKY1与西洋参PqWRKY1的核苷酸序列相似性为99.16%,氨基酸序列相似性为98.32%。将相关信息提交至GenBank,获得检索号为KU836935。(2)成功克隆得到人参转录因子ERF1基因的CDS序列,并将其命名为PgERF1。测序结果显示,PgERF1基因序列长度为936 bp,可以编码311个氨基酸。序列比对结果表明,PgERF1与西洋参PqERF1的核苷酸序列相似性为98.29%,氨基酸序列相似性为97.75%。将相关信息提交至GenBank,获得检索号为KU935742。(3)完成了PgHMGR、PgDS、PgD12H、PgP6H、PgUGT-D-3OH-1、Pg UGT-D-3OH-2、PgUGT-D-20OH、PgMYB、PgWRKY1、PgERF1基因核心片段的克隆。电泳检测结果初步表明,PCR反应程序设置比较合适,所用引物的准确性和特异性较好。(4)在低温胁迫和MeJA处理下,7个关键酶基因的表达量均上调;在盐胁迫下,PgHMGR、PgP6H、Pg UGT-D-20OH基因表达量上调,PgD12H的表达量变化不明显,PgDS、PgUGT-D-3OH-1、PgUGT-D-3OH-2表达量下调;在ABA处理下,7个关键酶基因的表达量均下调。(5)在低温胁迫下,转录因子基因PgMYB和PgERF1的表达量均上调,Pg WRKY1的表达量变化不明显;在盐胁迫下,3个转录因子基因的表达量均上调;在MeJA处理下,PgMYB和PgWRKY1的表达量上调,而PgERF1基因的表达量下调;在ABA处理下,PgWRKY1和PgERF1的表达量均上调,而PgMYB基因的表达量下调。(6)采用香草醛比色法进行人参发根总皂苷含量的测定,检测结果显示,与对照组(未经处理的)相比,经MeJA处理、低温胁迫、盐胁迫处理的人参发根总皂苷含量分别提高了约50%、17%、8%,而经ABA处理的总皂苷含量降低了约9%。(7)推测转录因子和关键酶之间的关系:PgMYB与PgD12H基因之间可能存在正相关关系,PgERF1与PgUGT-D-3OH-1、PgUGT-D-3OH-2基因之间可能存在负相关关系。

关键词：非生物胁迫信号传导分子人参皂苷生物合成关键酶基因转录因子 Real-time PCR

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秸秆固化成型机的设计与试验

秸秆固化成型机的设计与试验

作者：刘希锋吉林大学

学位级别：硕士

农作物秸秆是地球上第一大可再生资源，我国拥有量居世界首位。据统计，我国年产秸秆约8.4亿吨，目前我国秸秆综合利用率不高，经过技术处理后利用的秸秆不到10%，约23.7%的剩余秸秆被就地焚烧或闲置，引发了越来越严重的环境污染和社... 详细信息

农作物秸秆是地球上第一大可再生资源，我国拥有量居世界首位。据统计，我国年产秸秆约8.4亿吨，目前我国秸秆综合利用率不高，经过技术处理后利用的秸秆不到10%，约23.7%的剩余秸秆被就地焚烧或闲置，引发了越来越严重的环境污染和社会问题。秸秆固化成型(也称压缩、致密成型)是指将秸秆用机械加压的方法，使生物质原料压缩成具有一定形状的，密度较大的成型燃料。农作物秸秆一般都具有疏松、密度小、单位体积的热值低等缺点，作为燃料使用很不方便。生物质固化成型技术能有效地改变秸秆的燃烧特性，使秸秆的燃烧效率达到90%，比传统的燃烧效率高4倍。另外秸秆原料固化成型后，密度可达0.9～1.3t/m ，运输、储存、使用方便，可作为高品位的能源产品代替矿物能源用于生产和生活领域。本研究从秸秆压缩的成型机理及成型过程分析入手，分析了秸秆固化成型过程中的物理和化学变化，以及原料含水率、粉碎粒度、成型温度等因素对成型的影响，进而确定了秸秆固化成型工艺流程。秸秆固化成型机是加工秸秆成型燃料的关键设备，也是本研究的重点。根据工艺流程要求，本研究着重从整机结构与工作原理、成型机关键部件、润滑系统、控制系统等方面进行了研究分析，设计并试制了新型秸秆固化成型机。在秸秆固化成型机的试验研究中，采用正交试验的方法对影响秸秆燃料棒的3个主要参数：原料含水率、粉碎粒度、成型温度进行优化，筛选出最佳的生产加工工艺参数。通过上述研究，为秸秆燃料棒的设计开发及生产应用提供了主要技术参数依据。研究结果表明：该机适用于秸秆固化成型工厂化生产，具有较强的适应性与可靠性，生产的固化燃料产品符合国家相关标准，且操作方便、运行成本较低，既可作为农村个体加工的固化燃料生产设备，也可作为生物质燃料专业生产企业的工厂化生产设备，并可广泛应用于不同地区。

关键词：秸秆固化成型机机械活塞式设计试验

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人参发根诱导及高产发根无性系的筛选研究

人参发根诱导及高产发根无性系的筛选研究

作者：李昌禹中国农业科学院

学位级别：硕士

本试验建立了人参发根适宜的诱导方法。采用菌液针刺、菌脓涂抹和菌液共培养等方法，利用发根农杆菌A对吉参1号的根、茎及叶等外植体进行发根诱导试验。人参茎、叶、叶柄及幼根等外植体间，人参幼根诱导率高;不同诱导方法，以菌液滴加... 详细信息

本试验建立了人参发根适宜的诱导方法。采用菌液针刺、菌脓涂抹和菌液共培养等方法，利用发根农杆菌A对吉参1号的根、茎及叶等外植体进行发根诱导试验。人参茎、叶、叶柄及幼根等外植体间，人参幼根诱导率高;不同诱导方法，以菌液滴加法对人参发根的诱导率最高。结果表明，以人参二年生根片菌液滴加法诱导发根较好。利用rolC基因特异引物从人参发根R9923系基因组中扩增出0.8kb DNA片段，表明，其确为发根农杆菌A诱导的转化根。进行了高产发根R9923系的筛选研究。将生长较快的几个发根系进行液体培养，R9923系生长速率最高为28.8倍，发根干重最高达28.4克/L，总皂苷含量为1.52%，总皂苷产量高达0.432g/L。通过对各发根系生长速率、发根干重和总皂苷含量与产量等性状的综合比较，确定了高产人参发根R9923系。进行了发根系R9923生物产量及其皂苷的关系研究。发根生物量的形成大约经历以下时期：延迟生长期，对数生长期，直线生长期与减慢期。高效液相色谱分析表明，人参发根在整个生长期间，均有持续、稳定合成人参皂苷的能力，皂苷含量的变化与发根生长的周期性和培养液中糖等营养成分的消长有关，发根中皂苷的积累随生物量的增加而大幅度提高，二者呈正相关。优化了发根的培养条件，并初步研究了人参发根工厂化生产工艺，为人参发根工厂化生产奠定了理论基础。发根继代培养宜在N/5固体培养基上，悬浮培养液为1/2MS;发根培养时在2周前须进行补料，以保证发根的正常生长和皂苷的积累。发根种子罐接种量为3～5克，培养时间约2周，次级培养罐接种量为30克左右，再培养2周，即可转入生产罐中进行皂苷的生产，直至4周后采收。

关键词：人参发根诱导人参皂苷高效培养发根农杆菌

一株嗜热乳酸菌的鉴定及L-乳酸脱氢酶基因的克隆表达

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一株嗜热乳酸菌的鉴定及L-乳酸脱氢酶基因的克隆表达

作者：曹金钰吉林大学

学位级别：硕士

L-乳酸广泛地应用于食品和医药等领域,尤其是近年来聚乳酸(PAL)制品的出现,L-乳酸的市场前景被十分看好。国外特别是欧美发达国家关于基因工程菌发酵生产L-乳酸的研究较早,我国目前以根霉发酵研究为主,而以细菌发酵生产L-乳酸的报道不... 详细信息

L-乳酸广泛地应用于食品和医药等领域,尤其是近年来聚乳酸(PAL)制品的出现,L-乳酸的市场前景被十分看好。国外特别是欧美发达国家关于基因工程菌发酵生产L-乳酸的研究较早,我国目前以根霉发酵研究为主,而以细菌发酵生产L-乳酸的报道不多。本论文对一株从玉米淀粉生产车间浸泡水中筛选出的产L-乳酸的嗜热乳酸菌BAE0421进行了分类鉴定,进一步克隆其L-乳酸脱氢酶(ldhL)基因,并在大肠杆菌中实现了表达。研究方法及结果如下: 1、采用常规鉴定及16S rDNA序列分析方法对该菌进行了分类鉴定,结果确定BAE0421为凝结芽孢杆菌,并将菌BAE0421的16S rDNA序列提交GenBank获得登录号(AccessionNo.:FJ392315)。 2、根据鉴定结果中与其亲缘关系最近菌种的ldhL基因序列设计引物,以菌BAE0421基因组DNA为模板进行PCR扩增,将产物连接到pMD19-T克隆载体上进行测序分析,该菌的ldhL基因经测序全长为939bp,并获得GenBank登录号(AccessionNo.:FJ392314)。 3、将该基因序列连接到pET32a表达载体上,得到重组表达质粒pET-ldhL,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导8h后经SDS-PAGE电泳分析在37KD附近可见明显的特异性条带,利用紫外分光光度法测得工程菌的酶活为100.2U/mL,约为原始菌株酶活力的4倍,说明ldhL基因片段在大肠杆菌中得到了高效表达。

关键词： L-乳酸脱氢酶嗜热乳酸菌 16S rDNA序列分析克隆表达

盐胁迫对人参转录因子及皂苷合成酶基因表达能力的影响

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盐胁迫对人参转录因子及皂苷合成酶基因表达能力的影响

作者：崔悦吉林大学

学位级别：硕士

人参（Panax ginseng ***）是一种多年生五加科药用草本植物,主要应用于医疗和食品等一些领域。人参皂苷作为次生代谢产物是人参行使功能的主要活性成分之一,也是衡量人参品质优劣的重要指标。人参皂苷的合成受转录因子以及一系列关键... 详细信息

人参（Panax ginseng ***）是一种多年生五加科药用草本植物,主要应用于医疗和食品等一些领域。人参皂苷作为次生代谢产物是人参行使功能的主要活性成分之一,也是衡量人参品质优劣的重要指标。人参皂苷的合成受转录因子以及一系列关键酶的催化,同时也受到外界环境的影响,当环境改变时人参体内会快速启动应答机制。本文所研究的盐胁迫是影响较为广泛的环境胁迫因子之一。现阶段人参栽培已经由传统的伐林栽参向农田栽参等方式转变,与粮争地等问题随之产生,探索进一步扩大栽培区域、改良盐碱土地尤为重要。人参是如何感知外界环境变化并受到转录因子调控来影响人参皂苷含量的研究甚少,为此本实验进行初步筛选盐胁迫相关的转录因子,且由于人参的生长周期长,故本文以实验室保存的人参发根（由发根农杆菌侵染人参根部诱导产生的组织）为主要材料,利用荧光实时定量PCR技术分别进行三组平行实验研究对不同浓度模拟盐胁迫（100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L、250 mmol/L）及不同胁迫时间（0 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h）进行处理下的三种盐胁迫相关的人参转录因子基因（Pg MYB2、Pg HLH13、Pg ZIP2）、四种人参皂苷合成途径关键酶基因（Pg HMGR、Pg D12H、Pg UGT-D-3OH-1、Pg UGT-D-20OH）以及两种与盐胁迫相关的验证性激素合成关键酶基因,即水杨酸合成关键酶基因Pg SAPAL和赤霉素合成关键酶基因Pg GA-20ox1的相对表达量进行研究,并分析比较了不同盐浓度（不同取样时间）条件下,各基因间的相互作用关系。初步探究研究结果如下:（1）在不同浓度盐胁迫处理下,仅Pg UGT-D-3OH-1表达量始终处于下调;Pg HLH13、Pg ZIP2、Pg HMGR、Pg D12H、Pg UGT-D-20OH、Pg SAPAL、Pg GA-20ox1表达量上调;特殊的是,Pg MYB2表达量在150 mmol/L和200 mmol/L盐胁迫处理下表现上调,在100 mmol/L和250 mmol/L盐胁迫处理下表现下调。Pg MYB2、Pg HMGR、Pg D12H、Pg UGT-D-3OH-1、Pg UGT-D-20OH、Pg SAPAL随盐胁迫培养的浓度不同基因相对表达量受作用的程度为:200 mmol/L＞150 mmol/L＞100mmol/L＞250 mmol/L;Pg ZIP2、Pg GA-20ox1表达量随盐胁迫培养浓度的升高而升高;Pg HLH13随盐胁迫培养的浓度不同基因相对表达量受作用的程度为:250mmol/L＞100 mmol/L＞150 mmol/L＞200 mmol/L。（2）相同取样时间,不同盐胁迫浓度下,转录因子基因Pg MYB2、Pg HLH13及皂苷关键酶基因Pg HMGR、Pg D12H、Pg UGT-D-3OH-1、Pg UGT-D-20OH相对表达量整体趋势均表现为先下降再上升到达某一时间点后出现下调走向,均在胁迫处理3 h时相对表达量最低,胁迫处理18 h时相对表达量最高;Pg ZIP2在胁迫处理3 h时相对表达量最低,胁迫处理12 h时相对表达量最高。激素关键酶基因Pg SAPAL、Pg GA-20ox1相对表达量整体趋势均表现为先上升到达某一时间点后出现下调走向,在胁迫处理18 h时相对表达量最高。（3）相关分析的结果显示转录因子与关键酶基因之间的关系:盐胁迫条件下,人参转录因子基因Pg MYB2与皂苷生物合成途径四种关键酶呈正相关,相关系数均大于0.95;与人参水杨酸合成关键酶基因Pg SAPAL呈正相关,相关系数均大于0.98。转录因子基因Pg HLH13与四种皂苷合成关键酶基因呈负相关,相关系数均小于-0.85;与人参水杨酸合成关键酶基因Pg SAPAL呈负相关,相关系数均小于-0.63。转录因子基因Pg ZIP2与人参赤霉素合成关键酶基因Pg GA-20ox1呈正相关,相关系数均大于0.97。由此可以初步推断出,在人参皂苷合成途径中Pg MYB2和Pg SAPAL起正向调节作用,Pg HLH13起反向调节作用。

关键词：盐胁迫转录因子人参皂苷关键酶基因激素合成基因荧光实时定量PCR

Ri质粒介导人参发根表达人成纤维细胞生长因子2（FGF2）的研究

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Ri质粒介导人参发根表达人成纤维细胞生长因子2（FGF2）的研究

作者：孟洋吉林大学

学位级别：硕士

人参（Panax ***）系五加科（Araliaceae）多年生草本植物，含有皂苷、糖类、蛋白质、多肽氨基酸、维生素等多种活性物质。人参具有保湿润肤、抗氧化、抗紫外线对皮肤的损伤等美容功效，其提取物常作为重要成分添加在很多化妆品中。人... 详细信息

人参（Panax ***）系五加科（Araliaceae）多年生草本植物，含有皂苷、糖类、蛋白质、多肽氨基酸、维生素等多种活性物质。人参具有保湿润肤、抗氧化、抗紫外线对皮肤的损伤等美容功效，其提取物常作为重要成分添加在很多化妆品中。人成细胞纤维因子2(Fibroblast growth factor，FGF2)在人体内含量低，但FGF2是一种有活性多功能生长因子，它在促进组织生长发育、新血管形成、参与组织创伤修复过程等临床应用方面有着巨大的前景。本研究将FGF-2基因进行了克隆和纯化，利用PCR和双酶切方法构建植物表达载体;发根农杆菌A4介导将含有FGF-2基因的植物表达载体转入到人参细胞内，最终得到含有FGF2基因的转基因人参发根系;对转基因人参发根异源表达的FGF2蛋白进行鉴定和分析。为人参发根作为生物反应器生产药用蛋白的产业开发奠定了基础，同时也为FGF2基因大量生产提供了理论基础。本文的主要研究内容与结论如下： 1.植物表达载体以及工程菌构建：以pET16+FGF2载体为模板，将FGF-2基因进行大量克隆和纯化，然后利用PCR和酶切连接技术构建了植物表达载体，将构建好的载体命名为pBI121-FGF2。通过冻融法将pBI121-FGF2植物表达载体转入到发根农杆菌A4菌株中，构建工程菌命名为：A4-pBI121-FGF2。 2. A4-pBI121-FGF2对人参的遗传转化：利用制备好的工程菌A4-pBI121-FGF2和空pBI121质粒分别对三年生人参根片外植体进行侵染，诱导出人参发根;转基因组人参发根和空白对照组发根都表现出正常典型的发根形态，二者在形态变化上没有显著性差异;利用分子生物学的方法筛选含有FGF2外源基因的阳性克隆人参发根。 3.异源表达FGF-2蛋白的转基因人参发根鉴定：以A4-pBI121-FGF2工程菌诱导转化得到的转基因人参发根系为材料，利用分子生物生物学的方法检测FGF2基因整合到人参发根基因组中;提取人参发根蛋白，利用SDS-PAGE和Western blot证明外源基因FGF-2在人参发根内已经得到表达。 4.转基因人参发根总皂苷和部分单体皂苷的含量测定：测定结果表明，随着培养天数的增加，转基因发根中总皂苷含量与时间成正比例增长，在一个月后总皂苷的含量基本保持不变，30天时转基因人参发根总皂苷含量(22.51)高于空白对照人参发根总皂苷含量(20.47);利用高效液相法测得转基因人参发根中三种单体皂苷含量高于对照发根的三种单体皂苷含量。 5.转基因人参发根多糖含量检测：测定结果表明，培养30天时转基因人参发根粗多糖含量(11.5)高于空白对照人参发根粗多糖含量(9.5)，差异性显著（P﹤0.05）。

关键词：人参发根 FGF-2基因遗传转化异源表达生物反应器

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胶原蛋白酶产生菌的筛选及其产酶特性研究

胶原蛋白酶产生菌的筛选及其产酶特性研究

作者：周强强吉林大学

学位级别：硕士

胶原蛋白由于其独特的结构和功能,在食品、医药、化妆品等领域被广泛应用,而小分子胶原多肽在许多领域有着一定的优势。在胶原蛋白的提取工艺中,由于传统酸碱提取法会破坏蛋白质的活性,而且污染较大,胃蛋白酶等酶法提取时不能有效降解... 详细信息

胶原蛋白由于其独特的结构和功能,在食品、医药、化妆品等领域被广泛应用,而小分子胶原多肽在许多领域有着一定的优势。在胶原蛋白的提取工艺中,由于传统酸碱提取法会破坏蛋白质的活性,而且污染较大,胃蛋白酶等酶法提取时不能有效降解胶原蛋白,得不到小分子胶原多肽,因此本试验致力于从细菌中提取能够有效分解胶原蛋白的胶原酶,并对酶的性质及其在胶原蛋白提取中的应用做初步研究。研究内容和结果如下: 1.从土壤中筛选出一株胶原蛋白水解酶活力较高的菌株,通过菌株的生理生化试验和16S rDNA测序,初步将其鉴定为嗜麦芽寡养单胞菌,有关该菌胶原酶活力的研究到目前为止比较少见。 2.通过单因素试验和正交优化试验,得到了菌株JY-1产胶原酶的最佳培养条件:使用液体培养基(牛肉膏15g/l、葡萄糖10g/l、明胶5g/l、NaCl 5g/l,pH 7.5),装液量为75 ml/250 ml,接种量为7.5%,33℃,120 r/min摇床培养36 h。 3.通过离子交换、硫酸铵沉淀、分子筛层析等方法对含胶原酶的发酵液进行初步纯化,得到了胶原酶粗酶液,并对酶的性质进行了简单鉴定。通过试验发现,该胶原酶的最适pH为7.5,最适反应温度为33℃;二价金属离子对酶活力有促进作用;该酶在40℃以下时酶活力比较稳定,在45℃以上时酶活力的稳定性较差。 4.对胶原酶在骨胶原蛋白提取中的应用做初步研究。通过胃蛋白酶和胶原酶对脱钙骨粉的水解作用来看,胃蛋白酶对胶原蛋白的水解能力有限,只能把胶原水解成长链多肽,很难得到短肽片段,而胶原酶则可以将胶原水解成不同长度的短肽。另外,在骨胶原蛋白提取的过程中,骨的预处理很关键,试验证明,颗粒越小、脱钙越完全的骨粒(骨粉),其胶原蛋白提取的效果越好。

关键词：胶原蛋白胶原蛋白酶嗜麦芽寡养单胞菌菌种筛选产酶优化