检索结果-南通市图书馆

基于生物传感器电化学法超敏检测原癌基因选择性多聚腺苷酸化的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

基于生物传感器电化学法超敏检测原癌基因选择性多聚腺苷酸化的研...

作者：刘凤云南大学

学位级别：硕士

选择性多聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,APA)普遍存在于真核生物中,在基因的表达调控中起着重要的作用。通过APA调控,基因可以选择不同的多聚腺苷酸化位点,产生带有不同长度3’UTR(3’-Untranslated region)的mRNA异构体。研... 详细信息

选择性多聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,APA)普遍存在于真核生物中,在基因的表达调控中起着重要的作用。通过APA调控,基因可以选择不同的多聚腺苷酸化位点,产生带有不同长度3’UTR(3’-Untranslated region)的mRNA异构体。研究表明,在不同的癌细胞和癌组织中,基因特别是原癌基因更倾向于使用带有短链3’UTR的mRNA转录本,而且这种转录本与肿瘤的诊断分型和预后密切相关,因此它可以作为一种新型的肿瘤生物标志物,对它们的检测具有良好的临床价值和应用前景。尽管传统的生物学方法(qPCR、Northern blot、高通量测序等)在APA的检测中有诸多的应用,但这些方法或多或少存在的一些缺点限制了它们的应用,如:成本高、操作复杂、耗时久等。近年来,电化学检测技术引起了学界相当大的关注。与传统的生物学检测方法相比,电化学生物传感器法具有诸多突出的优越性能,如成本低、仪器设备小、实验操作简单、选择性好、灵敏度高等。但是,至今还没有用电化学方法检测基因APA的报道。为此,本研究把超分子材料、纳米粒子及生物探针有机结合起来构建生物传感器,有效地提高了检测的灵敏性及特异性,大大降低检测限度,对已在乳腺癌和肺癌中报道的Dicer1和CCND2两个原癌基因的APA实现了超敏检测,详述如下:第一部分:以磺化杯[6]芳烃(SCX6)和氧化石墨烯(GO)为原料,通过加热回流的方法合成得到了SCX6-RGO复合物,引入Au纳米材料增大传感能力,并用傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy,FTIR)、热重分析(Thermogravimetric Analysis,TGA)、Zeta电位(Zeta potential)、原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)等方法对制备的纳米材料进行材料表征。选择亚甲基蓝(Methylene blue,MB)作为电信号物质,通过差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry,DPV)进行电信号检测。选取人的乳腺癌细胞系BT474、SKBR3作为实际检测样品,通过总RNA提取和cDNA的反转,对这些cDNA样品进行Dicer1 APA的检测。结果显示,在两种乳腺癌细胞系中带短链3’UTR的Dicer1 mRNA的表达量(Dicer1-S)显著高于带长链3’UTR的转录本(Dicer1-L);检测到Dicer1-S的线性范围为:100M,检出限为3.5 fM;Dicer1-L的线性范围为100M,检出限为0.53 fM。检测结果也用传统的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)进行了验证,得到了相似的结果。因此,该生物传感器彰显了良好的特异性和灵敏性,具有潜在的应用价值实用性。第二部分:以磺化杯[8]芳烃(SCX8)和氧化石墨烯(GO)为原料,通过一步法制取SCX8-RGO复合物,同时用湿热法合成了FeO纳米材料,并加入Au纳米粒子(Au nanoparticals,AuNPs)分别合成Au@SCX8-RGO及Au@FeO复合材料。通过IR、TEM、XPS等方法对制备的材料进行表征,确认材料构建成功后,以甲苯胺蓝(Toluidine blue,TB)为电信号物质用丝网印刷电极对目标物进行DPV检测。选取人的肺癌细胞系H292及正常的肺组织细胞Base-2B作为实际检测样品,通过提取它们的总RNA,并直接对总RNA进行CCND2 APA的检测。结果显示在两种肺癌细胞系中带短链3’UTR的CCND2转录本(CCND2-S)表达量显著高于带长链3’UTR的CCND2转录本(CCND2-L)的表达量;CCND2-S的检测线性范围为:100M,检出限为0.176 aM;CCND2-L的检测线性范围为100M,检出限为9.5 aM。用qPCR进行结果的验证也得到相似的结果。本研究是第一次用电化学生物传感器的方法对由APA现象所产生不同的3’UTR异构体进行表达分析的工作,提示了APA可能作为一种潜在的生物标志物用于肿瘤的诊断和预后,为癌症的临床诊断提供了一种快速、超敏、便捷的检测方法。

关键词：选择性多聚腺苷酸化(APA) 肿瘤标志物电化学生物传感器纳米材料

砷通过mtROS介导的线粒体相关内质网膜功能障碍诱导铁死亡和急性肺损伤

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

砷通过mtROS介导的线粒体相关内质网膜功能障碍诱导铁死亡和急性...

作者：李梦蝶安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究的目的是分析线粒体相关内质网膜(MAMs)功能障碍是否介导砷(As)诱发的肺上皮细胞铁死亡和急性肺损伤(ALI)。方法:动物实验:首先建立不同剂量、不同时间砷暴露诱发动物急性肺损伤模型,将购自北京维通利华的SPF级雄性6-8周龄Ba... 详细信息

目的:本研究的目的是分析线粒体相关内质网膜(MAMs)功能障碍是否介导砷(As)诱发的肺上皮细胞铁死亡和急性肺损伤(ALI)。方法:动物实验:首先建立不同剂量、不同时间砷暴露诱发动物急性肺损伤模型,将购自北京维通利华的SPF级雄性6-8周龄Balb/c小鼠随机分为两组:对照组和As组,As组小鼠使用配制的Na As O染毒,时间效应组在As染毒后2h、6h、12h、24h、48h收集小鼠肺组织,剂量效应组分别选择5mg/kg和10mg/kg Na As O,对照组给予等量生理盐水气管内滴注,检测小鼠肺组织GPX4和Ferritin蛋白表达量。其次将Balb/c小鼠随机分为对照组、Fer-1组、As组和As+Fer-1组,Ferrostatin-1(Fer-1)预处理后气管内滴注Na As O进行染毒,分别在6h和24h后检测小鼠肺功能,其余小鼠在充分留血后处死保留小鼠肺组织,左肺固定在4%多聚甲醛中,留取右肺部分组织送检肺泡上皮细胞电镜检查,另外检测肺组织的GPX4和Ferritin蛋白表达。最后将Balb/c小鼠随机分为对照组、Mito Q组、As组和As+Mito Q组,在Mitoquinone mesylate(Mito Q)预处理后进行动物染毒,在As暴露24h后进行小鼠肺功能检测,处死小鼠后留存固定左肺组织进行HE染色,其余肺组织保存于-80℃超低温冰箱中,检测GPX4、Ferritin、CLPP和mt HSP70蛋白表达。细胞实验:首先确定小鼠肺上皮细胞(MLE-12)染毒的剂量和时间,选择不同剂量的Na As O进行CCK8实验,随后在Na As O染毒2h、6h、12h、24h后收集细胞蛋白检测GPX4、Ferritin、Mfn-2和p-PERK表达量。随后将MLE-12分为对照组、Fer-1组、As组和As+Fer-1组,Fer-1预处理后进行As(50μM)暴露,在染毒后6h和24h后,检测GPX4和Ferritin蛋白表达,同时测定脂质活性氧表达。其次将MLE-12细胞分为对照组、GSK2656157组、As组和As+GSK2656157组,GSK2656157预处理后进行As染毒,在As暴露6h和24h后收集细胞蛋白,检测GPX4、Ferritin、Mfn-2和p-PERK表达量。然后将MLE-12细胞分成对照组、Mito Q组、As组和As+Mito Q组,Mito Q预处理后进行染毒,在As暴露12h后检测GPX4、Ferritin、CLPP、mt HSP70、Mfn-2和p-PERK蛋白表达,另外进行Mfn-2和PERK荧光共定位、Mito-Tracker Red CMXRos和JC-1检测,用Co-IP方法检测Mfn-2和PERK表达。最后转染进行Mfn-2过表达,As染毒24h后检测Mfn-2和PERK蛋白表达。结果:As染毒后的小鼠肺泡结构受损,炎症细胞浸润,肺功能下降。在As暴露的肺和肺上皮细胞(MLE-12)中,铁过载标志物Ferritin升高,脂质过氧化指数GPX4降低。Ferrostatin-1(Fer-1)预处理可减轻砷诱发的ALI。此外,As诱导的Fe沉积在Fer-1预处理小鼠中受到抑制。此外,As引发的线粒体损伤和脂质活性氧(lipid ROS)过剩在Fer-1预处理的MLE-12细胞中得到了缓解。Fer-1预处理改善了As引起MLE-12细胞上铁标记物的变化。从机制上说,在As暴露的MLE-12细胞中观察到PERK发生磷酸化和Mitofusin-2(Mfn-2)减少。此外,在As暴露的MLE-12细胞中,PERK和Mfn-2的相互作用被下调,MAMs功能被破坏。有趣的是,PERK抑制剂和Mfn-2过表达可减轻As诱导的MLE-12细胞的铁死亡。此外,As暴露MLE-12细胞线粒体应激标志物CLPP和mt HSP70上调,线粒体ROS(mt ROS)升高,线粒体膜电位(MMP)和ATP降低。Mitoquinone mesylate(Mito Q)是一种线粒体靶向自由基清除剂,可减轻As诱导的肺上皮细胞过量mt ROS、线粒体应激、MAMs功能障碍。同样,在体内实验表明,Mito Q预处理可以抑制As诱导的肺上皮细胞铁死亡和ALI。结论:mt ROS引发的MAMs功能障碍至少部分与As诱发的铁死亡和ALI有关。

关键词：砷铁死亡线粒体相关内质网膜 mtROS 急性肺损伤

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

IPF氧化损伤发病机制和抗氧化治疗进展

IPF氧化损伤发病机制和抗氧化治疗进展

作者：彭战友山西医科大学

学位级别：硕士

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种原因不明的肺间质慢性弥漫性纤维化性疾病,以进行性呼吸困难、肺功能下降、预后差为特征,最终死于呼吸衰竭。近年来IPF的发病率呈上升趋势。肺内常见的氧化剂有超氧阴... 详细信息

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）是一种原因不明的肺间质慢性弥漫性纤维化性疾病,以进行性呼吸困难、肺功能下降、预后差为特征,最终死于呼吸衰竭。近年来IPF的发病率呈上升趋势。肺内常见的氧化剂有超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢、一氧化氮、过氧化亚硝基阴离子,其中以羟自由基损伤力最强。抗氧化剂有维生素E、α-硫辛酸、还原型谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、血红素加氧酶1和硫氧还蛋白等。抗氧化剂可直接清除氧化剂或催化氧化剂反应生成其他物质而减轻氧化损伤。氧化损伤在IPF发病过程中有重要作用,保持氧化剂和抗氧化剂平衡可抑制IPF的发展。氧化剂通过以下机制促进IPF的发展。氧化剂如ROS可直接损伤蛋白质、DNA、脂类等生物大分子;活化NF-κB和AP-1,引起炎症因子基因表达,生成的IL-1、TNF-α反过来也可活化NF-κB,TGF-β.等也能增加ROS的生成,形成正反馈。TGF-β1减少有抑制肺纤维化作用的PGE2生成,而ROS能增多促纤维化的LT及TXA2生成,导致炎症损伤;ROS能刺激多种细胞表达TGF-β,进而活化成纤维细胞成为肌成纤维细胞,而成纤维细胞是合成细胞外基质的主要细胞;引起蛋白酶/抗蛋白酶失衡,如基质金属蛋白酶/金属蛋白酶抑制剂失衡导致细胞外基质过度沉积;ROS增多引起的肺泡上皮细胞凋亡导致了肺泡基底膜的破坏,募集成纤维细胞通过细胞外基质的沉积来修复损伤,细胞外基质持续沉积,最终破坏了正常肺结构。这些最终导致IPF的发生,因此纠正氧化/抗氧化失衡能减缓IPF发展,减轻肺纤维化程度。抗氧化治疗IPF是一个很有前景的研究方向。目前IPF尚无有效的治疗药物,且激素和免疫抑制剂疗效欠佳,亟需开发新药物或寻找新治疗手段。用于实验性治疗IPF的抗氧化剂分为三类：非酶类抗氧化剂、酶类抗氧化剂、中草药。虽然已开始应用NAC、盐酸氨溴索、硫辛酸等治疗IPF,但其疗效不确定,仍需进一步的临床试验。本文通过查阅国内外文献资料,介绍了体内常见氧化剂和抗氧化剂、IPF氧化损伤发病机制、IPF抗氧化治疗、总结和展望四个方面的研究进展,并附一篇综述介绍IPF的治疗进展。

关键词：特发性肺纤维化氧化损伤抗氧化治疗进展

活性氧引起的内质网应激介导1-硝基芘诱导的上皮-间质转化和肺纤维化

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

活性氧引起的内质网应激介导1-硝基芘诱导的上皮-间质转化和肺纤...

作者：项莹安徽医科大学

学位级别：硕士

背景:1-硝基芘（1-NP）是细颗粒物（PM2.5）的一种关键的组成成分。广泛存在于大气、土壤和水源中。先前的报告显示,急性1-NP暴露会引起呼吸道炎症。但是长期暴露于1-NP中的后果仍没有相关的研究和报告,本项研究旨在调查慢性1-NP暴露是... 详细信息

背景:1-硝基芘（1-NP）是细颗粒物（PM2.5）的一种关键的组成成分。广泛存在于大气、土壤和水源中。先前的报告显示,急性1-NP暴露会引起呼吸道炎症。但是长期暴露于1-NP中的后果仍没有相关的研究和报告,本项研究旨在调查慢性1-NP暴露是否诱发肺纤维化及其其中可能存在的机制。目的:探讨慢性1-NP暴露是否能够诱发小鼠发生肺纤维化并探索内质网应激在1-NP暴露诱导EMT和肺纤维化中的作用。方法:动物实验:将购自北京维通利华的80只雄性C57BL6/J小鼠随机均分为两组:1-NP组和对照组。所有的小鼠均为6周龄,体重控制在20-22g。1-NP组小鼠用配制的1-NP溶液进行染毒（20μg/只/周）。对照组的处理用仅不含1-NP其余成分和比例完全相同的空白制剂处理。持续暴露六周,六周后两组中各留部分小鼠行肺功能检测,其余小鼠用颈椎脱臼法处死。处死后的小鼠开胸保留肺脏组织。随机每组选取部分左肺放置于4%多聚甲醛中保存。右肺保存在-80℃冰箱中。用HE染色观察小鼠肺部损伤及炎症弥漫程度,用免疫组织化学（IHC）检测小鼠上皮-间质转化（EMT）的标志物平滑肌肌动蛋白（a-SMA）分布及表达情况,用Masson染色测量测定肺部胶原沉积情况。细胞实验:将未接受任何处理的人非小细胞肺癌细胞（A549）分为2个组:1-NP组、对照组。1-NP组细胞长期暴露于1-NP（5μM/L）,对照组暴露于含千分之一DMSO培养基中。培养6周后观察细胞形态变化,并进行一些细胞形态学的相关实验,主要有细胞划痕、细胞迁移及侵袭实验。提取细胞蛋白,用Western blotting检测A549细胞中E-cadherin、波形蛋白（Vimentin）、N-cadherin、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、磷酸化的Smad2/3的表达情况。留取细胞培养基上清用人TGF-βELISA试剂盒检测A549细胞TGF-β分泌情况。另外将一部分未经任何处理的A549细胞分为六组:6h组、12h组、24h组和6h对照组、12h对照组、24h对照组。用活性氧检测试剂盒检测细胞活性氧产生情况。提取细胞蛋白用Western blotting检测A549细胞中磷酸化的IRE1α,PERK,e IF2α,GRP78,HO-1和NOX-4蛋白的表达量。结果:在1-NP暴露的小鼠肺脏中观察到弥漫性间质性炎症,上皮-间质转化（EMT）的标志物α平滑肌肌动蛋白（a-SMA）阳性细胞,通过Masson染色发现实验组小鼠肺部大量胶原沉积。肺功能显示,在暴露于1-NP的小鼠中肺动态顺应性（Cydn-min）降低。此外,在暴露于1-NP的小鼠中,吸气阻力（Ri）和呼气阻力（Re）升高。从机制上讲,在1-NP暴露的A549细胞中细胞迁移和侵袭被加速。上皮标记物E-cadherin被下调,而1-NP暴露的肺非小细胞肺癌细胞中Vimentin,a-SMA和N-cadherin（三个间充质标记蛋白）被上调。尽管TGF-β没有改变,但磷酸化的Smad2/3在1-NP暴露的肺非小细胞肺癌细胞中却增强了。此外,在暴露于1-NP的肺上皮细胞中,活性氧增加,内质网应激被激活。结论:长期暴露于1-NP会引起肺脏间质炎症,上皮间质转化和肺纤维化。其中活性氧诱发的内质网应激至少部分地导致了1-NP诱发的上皮间质转化和肺间质纤维化。

关键词： PM2.51-硝基芘上皮-间质转化内质网应激活性氧肺纤维化