检索结果-南通市图书馆

作者：周怡山东师范大学

学位级别：硕士

目前,国外对海洋被囊动物海鞘生理活性物质的研究进展迅速,分离获得了众多的活性物质,并且很多进入临床研究。但是,国内对海鞘的研究,尤其是海鞘中的天然产物的分离及其活性方面的研究尚处于起步阶段,不论在深度和广度上都有待提高。而... 详细信息

目前,国外对海洋被囊动物海鞘生理活性物质的研究进展迅速,分离获得了众多的活性物质,并且很多进入临床研究。但是,国内对海鞘的研究,尤其是海鞘中的天然产物的分离及其活性方面的研究尚处于起步阶段,不论在深度和广度上都有待提高。而我国海洋海鞘资源丰富,尤其是山东省沿海海域海鞘资源更是极其丰富,与国外相比,不仅没有得到有效开发利用,反而困扰着渔业和航海的发展,因此,应当引起人们极大的关注。本论文以生物碱为主要目标物,对柄海鞘(Styela clava)鞘体活性物质进行了初步的研究。首先,将采集到的新鲜柄海鞘冷冻保存,将柄海鞘的鞘体和鞘囊进行精细剥离,避免了物质的相互干扰,更好的进行活性物质的定位。对柄海鞘鞘体组织匀浆,冷冻干燥,用10%氨水充分湿润鞘体粉末,氯仿浸提,浓缩氯仿浸提液,浓缩液盐酸酸化,乙醚萃取去除脂溶性杂质,氢氧化钠碱化后分别用乙醚、氯仿重新萃取,浓缩蒸干得到碱化乙醚相(JY)和碱化氯仿相(JL);残渣继续经乙酸乙酯浸提,浓缩蒸干得到红褐色膏状物,经高效液相半制备得到样品YSYZ-P;而残渣经甲醇再次浸提,浓缩得到红棕色粘稠物,经盐酸酸化处理,结晶纯化得到无色透明晶体JC-C。其次,对样品进行了结构解析,样品YSYZ-P常温下为浅黄色液态,风干为凝固膏状物,冻干为小滴状。高效液相色谱分析表明样品较纯,根据其紫外光谱图、一维、二维核磁共振波谱图,并对照化合物数据库进行比对分析,初步推断其为胸苷。样品JC-C为无色透明晶体,呈长方体状,晶型较为规整,硬度较大,经粉末X-射线衍射分析,为未知物,无法断定其准确结构,初步推测为生物碱盐类。最后,利用细胞培养技术,采用MTT法初步检验柄海鞘鞘体提取物的抑瘤活性,实验数据显示,精制样品YSYZ-P体外抑瘤活性不稳定,没有浓度和时间规律性,200μg/ml浓度下作用于肝癌HepG2细胞24h抑制率最大,为49.42%;样品JC-C的抑瘤活性不呈现规律性的浓度和时间变化,200μg/ml浓度下作用于肝癌HepG2细胞72h时的抑制率最高,为48.97%。根据目前掌握的资料,本实验从柄海鞘中分离纯化出胸苷在国内尚属首例,在国内本领域的研究工作中具有一定的创新性,在本论文基础上,进一步深入开展广泛的筛选工作、化学及其生理活性的研究,可望发现结构新颖的生物活性物质,从而开发成为新药或作为药物设计的先导化合物,也可为基础生命科学研究提供有价值的工具药。相信,进一步的实验研究,必然会推进我国在此领域天然产物研究与开发的进度,开创海鞘生理活性物质研究的新局面。

关键词：柄海鞘分离纯化抑瘤活性

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柄海鞘化学成分的提取及活性研究

柄海鞘化学成分的提取及活性研究

作者：杨长军山东师范大学

学位级别：硕士

目前,国外对海鞘生理活性物质的研究正处于高速发展阶段,但关于柄海鞘的具有生理活性的提取物至今尚未见报道。我国学者对这方面的研究也比较少,很少涉及生理活性方面的实验。我国海鞘资源丰富,尤其以山东省最为丰富,但对其的开发利用... 详细信息

目前,国外对海鞘生理活性物质的研究正处于高速发展阶段,但关于柄海鞘的具有生理活性的提取物至今尚未见报道。我国学者对这方面的研究也比较少,很少涉及生理活性方面的实验。我国海鞘资源丰富,尤其以山东省最为丰富,但对其的开发利用没有进行相应的进展,而且还极大的困扰着渔业和航海的发展,因此,人们应对其投入更大的关注。本文从以下几个方面对柄海鞘生理活性物质进行初步的研究。首先,对柄海鞘的鞘囊和鞘体进行剥离,实验中对柄海鞘的鞘囊中的化学成分进行研究,采用传统的提取分离方法,用100%的氯仿进行浸泡得到浸膏状物质。然后,采用甲醇进行复溶,得到甲醇复溶物,采用硅胶柱层析,采用氯仿/甲醇作为流动相,得到不同的11个组分,通过高效液相分析,F-2组分的峰型较好,在通过反复的硅胶柱层析,对F-2组分进行分离纯化,得到FG-2,FG-4这两种组分适合进一步的纯化,采用高速逆流色谱等方法对这两种组分进行纯化得到两种纯度高的化合物Y-1,Y-2。其次,利用核磁共振、质谱、气质联、液质联等结构分析方法对Y-1,Y-2等进行结构解析,结果表明Y-1是一种长链醇醚类物质,Y-2是邻苯二甲酸丁基-2-异丁酯。最后,利用细胞培养技术测定Y-1、Y-2的抗肿瘤活性。采用较为常用的MTT法初步检测了这两种化合物对癌细胞的活性的抑制作用。实验结果表明,Y-1对HepG2细胞作用48h有一定促增殖的作用,而对HO8910pm作用中,100μg/mL作用24 h有最大的抑制作用22.94%。Y-2对肝癌细胞都没有较好的抑制作用,对HO8910pm细胞作用24 h,各个浓度都表现出了一定抑制作用,其最大的抑制率为17.28%,但在48 h作用时间下,抑制作用均减弱。本论文没有得到有很强的抗肿瘤的产物,但是研究工作中具有一定的创新性,在论文基础上,进一步深入开展广泛的筛选工作、化学及其生理活性的研究,可望发现结构新颖的生物活性物质,从而开发成为新药或作为药物设计的先导化合物,也可为基础生命科学研究提供有价值的工具药。相信,进一步的实验研究,必然会推进我国在此领域天然产物研究与开发的进度,开创海鞘生理活性物质研究的新局面。

关键词：柄海鞘抗肿瘤活性分离纯化海鞘

基于1H NMR代谢组学分析马尾松花粉硫酸酯化多糖对RAW264.7的影响

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基于1H NMR代谢组学分析马尾松花粉硫酸酯化多糖对RAW264.7的影响

作者：苏芳晨山东师范大学

学位级别：硕士

多糖因其特殊的结构而具有多种生物学活性。许多研究表明多糖具有多种功能活性,例如抗病毒、抗肿瘤以及提高免疫力等功效。多糖的修饰往往能改变其功能活性,本实验室的前期工作已证明马尾松花粉硫酸酯化多糖SPPM60-D恢复了免疫抑制型巨... 详细信息

多糖因其特殊的结构而具有多种生物学活性。许多研究表明多糖具有多种功能活性,例如抗病毒、抗肿瘤以及提高免疫力等功效。多糖的修饰往往能改变其功能活性,本实验室的前期工作已证明马尾松花粉硫酸酯化多糖SPPM60-D恢复了免疫抑制型巨噬细胞RAW264.7的免疫活性,而马尾松花粉多糖PPM60-D的作用效果甚微。此外,有研究发现马尾松花粉硫酸酯化多糖SPPM能够抑制体内和体外肿瘤细胞的增殖,同时可以促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖,且比马尾松花粉多糖PPM的作用效果明显。本论文采用基于核磁共振的代谢组学技术分析马尾松花粉硫酸酯化多糖对巨噬细胞RAW264.7代谢的影响。实验分为以下六个部分:一、采用水提醇沉法提取松花粉粗多糖,采用三氯乙酸法除蛋白质,用聚丙烯酰胺凝胶柱层析对60%乙醇沉淀的多糖进行分离纯化,并重复多次,最终得到较为均一的多糖组分,将其命名为PPM60-D。采用氯磺酸-吡啶法对较为均一的多糖组分进行硫酸酯化修饰,并将其命名为SPPM60-D。二、用MTT法分别检测梯度浓度的PPM60-D和SPPM60-D对小鼠巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响。检测结果与前期实验室研究得到的结果相同:800μg/mL浓度的SPPM60-D能显著增强小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖能力。因为SPPM60-D在400μg/mL和800μg/mL浓度下,对巨噬细胞RAW264.7的增殖能力均有明显的增强作用,又由于多糖提取工艺较为复杂,所以经综合考虑,选取400μg/mL作为SPPM60-D的作用浓度。三、细胞萃取液的制备。采用冷甲醇猝灭法和直接刮取法获取细胞,选取甲醇-氯仿和超纯水两相体系对细胞内液进行萃取。使用超声破碎仪破碎细胞,然后涡旋振荡,静置后离心,取上层水相旋转蒸干后重溶于D2O,经冷冻干燥后再溶于D2O和D2O配制的磷酸缓冲液。离心后取上清加入核磁管。四、采用瑞士Bruker AVANCEⅢ600型核磁共振波谱仪检测处理过的样本,通过查阅相关文献、人类代谢组数据库(HMDB)和生物核磁共振数据库(BMRB)对代谢物进行指认和归属,共鉴定出35种代谢物,主要是氨基酸、胆碱、有机酸和醇类代谢物。五、进行多元统计分析。将数据导入SIMCA-P+12.0软件(Umetrics Inc.,Umea,Sweden)进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。结果表明:在第一主成分这一维度上,SPPM60组和脂多糖LPS组与空白对照组的样本点之间得到较好的区分。为了进一步分析LPS和SPPM60-D对巨噬细胞RAW264.7胞内代谢物的影响以及组间差异,根据第一预测主成分(predictive component)的变量权重重要性(variable importance in projection,VIP)排序值以及载荷权重(1oading weights)和相关系数(correlation coefficients,Pcorr)值得到差异性代谢物。具体结果如下:脂多糖LPS组相对于空白对照组,其胞内代谢物浓度上升的有13种,分别是丙氨酸、胆碱、脯氨酸、甜菜碱、甘氨酸、乙酸、天冬氨酸、肌酸、尿苷、苏氨酸、甲醇、亮氨酸、乙醇;其胞内代谢物浓度下降的有5种,分别是乳酸、牛磺酸、甲酸盐、氧化三甲胺、谷氨酰胺。SPPM60-D组相对于空白对照组,其胞内代谢物浓度上升的有12种,分别是甜菜碱、脯氨酸、胆碱、甘氨酸、丙氨酸、肌酸、乙酸、天冬氨酸、磷酸肌酸、氧化三甲胺、异亮氨酸、苏氨酸;其胞内代谢物浓度下降的有3种,分别是乳酸、牛磺酸、乙醇。其中变化趋势与脂多糖LPS组相反的共有2种,氧化三甲胺在SPPM60-D组中浓度呈上升趋势,乙醇在SPPM60-D组中浓度呈下降趋势。通路富集分析表明SPPM60和LPS都通过上调蛋白质合成、甜菜碱代谢以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸等代谢途径并且下调牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径来促进巨噬细胞增殖。通过对差异代谢物的分析表明,LPS和SPPM60-D都通过促进巨噬细胞RAW264.7的有氧呼吸、降低糖酵解、增加能量代谢和蛋白质脂肪代谢来促进细胞的增殖。但其具体作用机理以及LPS和SPPM60-D对细胞作用的途径的差别还需要更深入的研究。

关键词：核磁共振代谢组学硫酸酯化多糖 RAW264.7 马尾松花粉

松花粉醇提物的分离及对3T3-F442A前脂肪细胞增殖、分化的影响

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松花粉醇提物的分离及对3T3-F442A前脂肪细胞增殖、分化的影响

作者：韩丽荣山东师范大学

学位级别：硕士

松花粉被冠有“完全营养库”的美称，破壁的马尾松（Pinus massoniana）花粉中含有多种生命活性物质，具有轻身健体、抗肿瘤、抗氧化、润心肺等诸多功效。虽然有较高的开发价值，但对于松花粉的分离和提取及其成分结构分析方面的研究还... 详细信息

松花粉被冠有“完全营养库”的美称，破壁的马尾松（Pinus massoniana）花粉中含有多种生命活性物质，具有轻身健体、抗肿瘤、抗氧化、润心肺等诸多功效。虽然有较高的开发价值，但对于松花粉的分离和提取及其成分结构分析方面的研究还亟待补充。本文主要是利用中压液相制备色谱(medium pressure liquid preparation chromatography，MPLC)分离经石油醚提取的马尾松花粉醇提物，利用紫外全波长扫描检测各组分的最大吸收峰波长，通过改变流动相及其比例、流速等条件探究松花粉醇提物的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)检测条件和中压制备色谱层析分离条件，并进行气相色谱(gas chromatographic，GC)和液相-质谱联用仪(liquid chromatographytandem mass spectrometry, LC-MS)检测。四甲基偶氮唑盐比色法(methylthiazolyltetrazolium，MTT)检测马尾松花粉醇提物对3T3-F442A前脂肪细胞增殖的影响;利用油红O染色技术观察各组分对3T3-F442A前脂肪细胞诱导分化的影响，并进行脂质含量的半定量测定。分别从药物浓度和作用时间两方面， MTT法实验检测所分离的组分C2对人的肝癌细胞HepG2增殖的影响。得到如下结论：一、经石油醚提取的马尾松花粉醇提物的分离纯化条件的探究（1）经石油醚提取的马尾松花粉醇提物A利用硅胶（200目-300目）柱中压分离层析，条件为：检测波长是241.00nm;流动相为正己烷和乙醚（66%:34%）;流速为10mL/min。按峰收集，得到B1、B2、B3、B4、B5。利用100%甲醇洗脱，得到组分B0。（2）选择B0进行C18柱（4.6×250mm，5m）高效液相色谱检测，条件为：检测波长是241.00nm、272.00nm;流动相是甲醇和水（9:1）;流速为0.5mL/min;进样量是20L。B0组分的中压液相制备色谱分离纯化条件为：柱子填料为C18;检测波长是272.00nm;流速为2.5mL/min;流动相为甲醇和水（9:1）;进样量是15mL。B0组分的中压液相制备色谱分离收集条件为：每管2mL，共收集30管记为1-30号，其中1-9号合并记为组分C1，10-20号合并记为组分C2，21-30号合并记为组分C3。（3）对组分C系列进行紫外全波长扫描。C1组分在204.00nm处有最大吸收峰，吸光值为0.831，C2组分在221.00nm处有最大吸收峰，吸光值为2.687，C3组分在207.00nm和290.00nm处有吸收峰，吸光值分别为1.191和0.268，三种组分的最大吸收峰波长有明显差别，结果说明本研究中初步探究得到的利用中压液相制备色谱分离B0的条件是合理可行的。（4）马尾松花粉醇提物C2组分进行高效液相色谱检测的条件是：检测波长为272.00nm、241.00nm，流动相为甲醇和水，流动相分离比是80%甲醇和20%水，流速为0.5mL/min。高效液相色谱检测到在20-25min之间出现两个分离效果较好的峰，据液-质联用分析仪（LC-MS）分析结果推测这两类物质分子量可能是442.2622。对于C2组分中压液相制备色谱分离条件的初步探究结果显示：利用甲醇和水作为流动相，进行梯度洗脱时分离效果较好;检测波长设为241.00nm，流速为2.5mL/min，每2min收一管，共收集30管。其中4-8号管合并记为D1，19-21号管合并记为D2。分别对D组分进行高效液相色谱检测，与C2组分的HPLC结果图对比，D1组分和D2组分的HPLC检测结果图谱有明显的区别，该结果表明本论文中提出的中压梯度分离组分C2是合理的。二、马尾松花粉醇提物对3T3-F442A前脂肪细胞的增殖、分化的影响马尾松花粉醇提物能够促进3T3-F442A前脂肪细胞的增殖，相同浓度的花粉醇提物，随着物质组分的不断分离纯化促进作用越来越弱。马尾松花粉醇提物能够促进3T3-F442A前脂肪细胞的分化，引起前脂肪细胞的形态变化，一定程度上提高了细胞分化率，其中C2的诱导分化作用最强。虽然马尾松花粉醇提物能够促进3T3-F442A前脂肪细胞的增殖和分化，但是与空白对照组相比均无显著性差异。三、马尾松花粉醇提物C2对人肝癌细胞HepG2细胞增殖的影响当马尾松花粉醇提物的C2浓度小于0.01mg/mL时，对肝癌细胞的影响不明显。当浓度在0.01mg/mL-1.00mg/mL时，组分C2能够显著性地抑制肝癌细胞的增殖，其中当浓度为0.5mg/mL时，抑制作用与空白对照组相比有极显著性差

关键词：松花粉醇提物分离 3T3-F442A前脂肪细胞 HepG2细胞

松花粉硫酸酯化多糖影响RAW264.7细胞胞质信号通路的研究

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松花粉硫酸酯化多糖影响RAW264.7细胞胞质信号通路的研究

作者：陆洋山东师范大学

学位级别：硕士

本实验室近两年来对马尾松花粉多糖的研究多集中于多糖对免疫细胞的代谢组学方面影响,不同分子量多糖对免疫细胞的影响以及荧光标记松花粉多糖与细胞作用。对马尾松花粉的荧光标记流程,在本实验室中已有较成熟的技术。然而对生物活性更... 详细信息

本实验室近两年来对马尾松花粉多糖的研究多集中于多糖对免疫细胞的代谢组学方面影响,不同分子量多糖对免疫细胞的影响以及荧光标记松花粉多糖与细胞作用。对马尾松花粉的荧光标记流程,在本实验室中已有较成熟的技术。然而对生物活性更强的硫酸酯化松花粉多糖能否进行荧光标记鲜有研究。之前本实验室的表明荧光标记的马尾松花粉多糖能够进入细胞。在荧光标记多糖进入细胞这一过程中,Toll样受体4(TLR4)和网格蛋白都发挥了重要作用,并且很大比例上是通过胞饮作用完成的。鉴于之前实验结果显示,荧光标记的多糖可以以极快的速度进入细胞,因此我们推测多糖进入细胞后可能会参与胞质内受体介导的下游免疫应答的激活。本实验探究多糖进入细胞后是否能与胞质内受体NOD2和NLRP3相互作用引发下游免疫应答。本文主要包含以下内容:一、利用本实验室熟练应用的水煮醇沉方法提取破壁马尾松花粉多糖。首先破壁松花粉先用热水浸提,使用三氯乙酸法除蛋白之后用20%、40%、60%、80%浓度的乙醇分级沉淀。使用活性较强的60%乙醇沉淀出的多糖作为本实验的研究对象,命名为PPM60。检测其多糖含量为47.32%。利用中压制备色谱技术对粗多糖PPM60组分进行纯化,预实验结果发现PPM60纯化后的第三峰标记情况最好,故之后实验选用第三纯化峰作为实验对象,命名为PPM60-III。二、PPM60-III的硫酸酯化以及荧光标记。利用氯磺酸—吡啶法对PPM60-III进行硫酸酯化,所得产物冻干后命名为SPPM60-III。检测其硫酸取代度为1.21。将SPPM60-III与酪氨发生反应,冻干后命名为SPPM60-Tyr-III。SPPM60-Tyr-III与异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)反应,冻干后命名为FSPPM60-III。检测其荧光取代度为0.43%;再次检测多糖含量为71.74%。三、利用MTT法检测FSPPM60-III对小鼠巨噬RAW264.7细胞活性的影响,发现200?g/mL浓度的FSPPM60-III对RAW264.7细胞的活性最好。选用FDSS作为阳性对照,发现200?g/m L浓度的FDSS对RAW264.7细胞的活性最好;对于未硫酸酯化和荧光标记的多糖PPM60-III在浓度达到400?g/m L时才显著促进细胞增殖。后续实验中,选取200?g/mL FSPPM60-III和FDSS,400?g/m L PPM60-III为实验浓度。利用黏附实验、划痕愈合实验和中性红实验分别检测FSPPM60-III对RAW264.7细胞贴壁、迁移和吞噬能力的影响,发现FSPPM60-III能够显著提升RAW264.7细胞贴壁能力和吞噬能力,然而对RAW264.7细胞的迁移能力并没有显著性影响;PPM60-III能够显著提升RAW264.7细胞吞噬能力;而FDSS对RAW264.7细胞贴壁、迁移和吞噬能力没有显著性影响。四、利用激光扫描共聚焦显微镜观察FSPPM60-III和FDSS确实能够进入到细胞中;流式细胞术检验FSPPM60-III组和FDSS组中带FITC信号的细胞分别占到5%和24.3%。五、通过免疫荧光标记检测荧光标记多糖能够与NOD受体发生共定位。通过添加NOD2受体抑制剂Ponatinib和NLRP3受体抑制剂MCC950作用于荧光标记多糖处理的RAW264.7细胞后,FSPPM60-III和FDSS与受体的共定位情况减少。通过添加Ponatinib和/或MCC950,发现多糖进入RAW264.7细胞的量降低。六、通过对胞内钙离子浓度变化的检测发现FSPPM60-III与FDSS都能够增加胞内钙离子浓度。添加Ponatinib和MCC950作用于多糖处理过的细胞后,胞内钙离子的增加显著降低。通过ELISA试剂盒检测细胞对四种细胞因子IL-6、TNF-?、IL-1?和IL-18的分泌量变化情况,发现FSPPM60-III与FDSS都能够使培养基中四种细胞因子浓度显著增加。添加Ponatinib和MCC950作用于多糖处理过的细胞后,培养基中细胞因子的增加显著降低。本实验成功地对马尾松花粉多糖同时进行硫酸酯化和荧光标记,得到产物FSPPM60-III。证实了FSPPM60-III能够进入到小鼠巨噬RAW264.7细胞中,能够与胞内受体NOD2和NLRP3共定位并且这两种受体可能参与介导多糖对RAW264.7细胞免疫活性的影响过程,其中包括[Ca]浓度的变化和多种细胞因子分泌量的变化。

关键词： RAW264.7 细胞内受体松花粉多糖荧光标记硫酸酯化

松花粉壁对脂肪肝和血脂异常小鼠肠道菌群及生物标志物的影响

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松花粉壁对脂肪肝和血脂异常小鼠肠道菌群及生物标志物的影响

作者：宋晓山东师范大学

学位级别：硕士

本实验室近年来对于云南松（Pinus yunnanensis）花粉生理功能的研究主要集中于松花粉的多糖和营养成分丰富的内容物,并发现其对多种疾病和癌症的发生具有预防和抑制作用。而松花粉壁在花粉中占比近40%,主要成分为纤维素和孢粉素。目前... 详细信息

本实验室近年来对于云南松（Pinus yunnanensis）花粉生理功能的研究主要集中于松花粉的多糖和营养成分丰富的内容物,并发现其对多种疾病和癌症的发生具有预防和抑制作用。而松花粉壁在花粉中占比近40%,主要成分为纤维素和孢粉素。目前已有大量对于膳食纤维通过肠道菌群改善机体代谢的研究,但对于松花粉壁改善机体代谢的探究还尚未见报道。本实验利用提纯的松花粉壁喂养小鼠,探究它对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝和血脂异常的有益作用。一、通过对于提取试剂和条件的优化,最终利用α-淀粉酶、β-淀粉酶和蛋白酶处理,并用乙醇、水分别洗涤三次,获得了不含蛋白质、糖类、脂肪等营养成分的纯度较高的松花粉壁,得率约为43.75%,主要成分为纤维素和孢粉素,其中纤维素约占41.80%,用于后续的实验。二、利用C57BL/6雄性小鼠建立高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝和血脂异常模型（MC）,同时设置对照组（HC）、含2.5%松花粉壁的实验组（PW）和含2.5%大豆膳食纤维的阳性对照组（FC）,喂养小鼠42天后取其肝脏、血清、肾周和附睾脂肪,测定其体脂比、肝指数、血脂水平、炎性细胞因子TNF-α和IL-6,观察肝脏病理组织切片,发现高脂饮食诱导引起了小鼠肝脏脂肪病变,体脂比、肝指数略微上升,血清TC、HDL-C、LDL-C水平显著升高,肝脏细胞因子TNF-α和IL-6水平显著升高,血清TG水平无变化;松花粉壁的摄入能够预防高脂饮食诱导的小鼠体脂增加和肝脂肪病变,降低肝脏炎症细胞因子TNF-α和IL-6水平,缓解血清TC和HDL-C水平的升高,对肝指数和血清LDL-C的水平的影响有限;与松花粉壁相比,大豆膳食纤维的摄入能够预防高脂饮食诱导的小鼠体脂增加,降低肝脏炎症细胞因子TNF-α水平,缓解血清HDL-C水平的升高,但对肝脏脂肪病变、肝指数、IL-6水平以及血清TC、LDL-C水平的影响有限。三、利用H NMR核磁共振光谱技术对小鼠盲肠内容物进行代谢组学分析,通过多元统计分析发现四组小鼠的盲肠内容物均能够实现区分,与数据库匹配后鉴定出胆酸、脂肪酸、短链脂肪酸（SCFAs）、糖类和氨基酸等代谢物的含量变化,其中具有标志性的代谢物包括胆汁酸、亮氨酸、泛酸以及棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸等长链脂肪酸,它们的水平普遍在高脂诱导后显著升高,并在松花粉壁和大豆膳食纤维摄入会后有不同程度的降低,而SCFAs的含量在模型组不同程度降低,在松花粉壁和大豆膳食纤维摄入后明显缓解。通过MetPA分析得出其涉及的代谢通路,发现松花粉壁中纤维素的摄入能够预防高脂饮食引起的小鼠胆汁酸、脂肪代谢异常,缓解短链脂肪酸含量的降低。同时,松花粉壁中纤维素和大豆膳食纤维的摄入引起了糖类代谢物的增加,结合孢粉素的分子结构和代谢组学的分析结果,我们推测孢粉素在小鼠肠道中无法被降解利用。四、利用Illumina MiSeq测序平台对小鼠盲肠内容物和粪便中的肠道菌群进行分析,探究其物种多样性、各个分类水平上群落结构和组成的变化,发现高脂饮食诱导使小鼠肠道菌群严重失调,厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著升高,其中来自于拟杆菌门的理研菌科、瘤胃球菌科、Marinifilaceae、拟普雷沃氏菌属以及另枝菌属、毛螺菌科、乳杆菌属等有益菌的丰度显著降低,而肠杆菌科、葡萄球菌属、螺杆菌属等有害菌丰度显著升高;松花粉壁的摄入能够缓解高脂饮食引起的小鼠粪便中肠道菌群失调,提高有益菌的丰度,如理研菌科、瘤胃球菌科、副杆菌属、拟普雷沃氏菌等拟杆菌门物种,并有效缓解了葡萄球菌科、脱硫弧菌属以及变形菌门多种有害菌丰度的升高,从而调节机体代谢,增加SCFAs的产生,在缓解非酒精性脂肪肝和血脂异常上发挥积极作用;大豆膳食纤维的摄入未表现出对肠道菌群失调的有效影响,仅发现韦荣球菌科的丰度降低,Faecalibaculum和葡萄球菌属的丰度显著增加。在盲肠内容物中,松花粉壁和大豆膳食纤维均未表现出对肠道菌群失调的缓解作用,大豆膳食纤维显著增加了Faecalibaculum和Akkermansia的丰度,说明松花粉壁和大豆膳食纤维的主要在大肠阶段发挥作用。本实验成功的提取到纯度较高的松花粉壁,并证实了松花粉壁可能通过调节胆汁酸、脂肪代谢、SCFAs含量以及肠道菌群的组成和结构来发挥它对脂肪肝、血脂异常和炎症的预防作用,且发生以上效用的成分可能主要为松花粉壁中的纤维素,而孢粉素在动物体内可能无法被消化利用。因此,松花粉壁可部分被机体利用而发挥积极的生理作用,这对于松花粉更有效地应用于保健产品具有重要的意义。

关键词：松花粉壁非酒精性脂肪肝血脂异常肠道菌群代谢组学

基于代谢组学技术寻找日照绿茶标志性代谢物并探究其应用

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基于代谢组学技术寻找日照绿茶标志性代谢物并探究其应用

作者：王凯利山东师范大学

学位级别：硕士

绿茶是中国的主要茶类之一,由于其未经发酵,保留了鲜叶的天然物质,研究表明,绿茶中含有茶多酚、儿茶素、叶绿素、咖啡碱、氨基酸、维生素等多种营养成分,具有提神清心、清热解暑、降火明目、防衰老、防癌抗癌、抑制心血管疾病等功能。... 详细信息

绿茶是中国的主要茶类之一,由于其未经发酵,保留了鲜叶的天然物质,研究表明,绿茶中含有茶多酚、儿茶素、叶绿素、咖啡碱、氨基酸、维生素等多种营养成分,具有提神清心、清热解暑、降火明目、防衰老、防癌抗癌、抑制心血管疾病等功能。日照绿茶产于山东省日照市,是“南茶北移”成功的范例,有“江北第一茶的美誉”。受气候、土壤等条件的影响,由于生长期长,昼夜温差大,光照强度低,漫射光多,日照绿茶各种营养物质的含量较丰富,具有干茶色泽翠绿油润,汤色黄绿明亮,栗香浓郁、回味甘醇的特点。但是,市场上绿茶种类繁杂,鱼龙混珠的情况严重,而日照绿茶区别于其他产地茶叶整体的成分变化规律还不明确,这就需要对日照绿茶和其他茶叶的化学组成进行系统地分析。本次实验应用基于液相色谱-质谱联用(Ultra Liquid chromatography mass spectrometry,UHPLC-MS)的代谢组学技术,对日照绿茶和市场上购买的低价绿茶进行了代谢组学分析。本实验使用的超高效液相色谱串联四极杆-轨道阱高分辨质谱的技术具有分离度高、分辨率高的特点,可以对茶叶样本中的物质进行更精确的测定。本次实验的主要研究内容有:一、建立高效快速的超高效液相色谱-质谱联用分析方法,对不同茶树品种、不同产地的日照绿茶和低价绿茶化学组成进行分析测定,以便对数据进行多元统计分析。二、运用超高效液相色谱-质谱联用分析方法对日照绿茶四个主要产区(五莲县、莒县、东港区、岚山区)的绿茶样本进行测定,并运用主成分分析和偏最小二乘判别分析对不同组的样品进行多元统计分析,结果显示,日照绿茶在PCA图上分离度不好,在对样本进行模型拟合时,R2X和Q2的值都偏小,模型的预测能力和可靠度较低,排列置换检验的结果也不理想,所以,我们推论,日照绿茶四个主要产区的茶叶样品没有很显著的差异,所以在PCA得分图上不能明显分开,在导致在模型拟合时,没有提取到可以使不同产地样本分离的有效的主成分,所以导致了模型的R2X和Q2偏小。三、运用超高效液相色谱-质谱联用分析方法对不同茶树品种的日照绿茶样本进行测定,并运用主成分分析和偏最小二乘判别分析对不同组的样品进行多元统计分析,结果显示,在PCA得分图上,不同茶树品种的茶叶样本分布没有明显的规律性,所拟合模型的预测能力和可靠度也不理想,所以,我们推论,不同茶树品种的日照绿茶的差异也不明显,导致在模型拟合时无法提取到使不同样本分离的有效主成分,进而导致了模型拟合不理想的现象。四、运用超高效液相色谱-质谱联用分析方法对日照绿茶和市场上购买的低价绿茶化学成分进行测定,并运用主成分分析和偏最小二乘判别分析对不同组的样品进行多元统计分析,结果显示,无论从正谱数据还是负谱数据上看,日照绿茶和低价绿茶间都有明显差异。两组样本在PCA和PLS-DA得分图上都可以有效分离,所拟合模型的预测能力和可靠度都比较高,PCA结果中,R2的值都大于0.6,PLS-DA结果中,R2都大于0.9。五、通过多元统计技术,结合VIP值、p-value、含量等参数,对日照绿茶和低价绿茶两组样品中的差异性代谢物进行筛选,本实验选取VIP值大于1、p-value小于0.01、含量比值至少大于20倍的物质作为潜在差异代谢物,正谱中共筛选出90种潜在差异代谢物,负谱中筛选出30种潜在差异代谢物,这些物质在两组样品中的含量有非常显著的差异。

关键词：日照绿茶代谢组学高效液相色谱质谱联用主成分分析偏最小二乘判别分析 VIP值 p-value 差异代谢物

基于GC-IMS和UPLC-MS/MS代谢组学技术分析不同酱油和食醋中的差异

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基于GC-IMS和UPLC-MS/MS代谢组学技术分析不同酱油和食醋中的差异

作者：杨晓璇山东师范大学

学位级别：硕士

酱油和食醋是我国传统的发酵调味品,也是我国目前使用较为广泛的两种调味品,甚至在世界范围内都深受消费者的青睐。作为发酵调味品,酱油和食醋具有种类丰富的风味物质,而不同的酱油或食醋由于使用的原料、发酵菌种、发酵方式、生产工艺... 详细信息

酱油和食醋是我国传统的发酵调味品,也是我国目前使用较为广泛的两种调味品,甚至在世界范围内都深受消费者的青睐。作为发酵调味品,酱油和食醋具有种类丰富的风味物质,而不同的酱油或食醋由于使用的原料、发酵菌种、发酵方式、生产工艺等均有差异,使得成分存在差异,甚至在风味和感官体验上也有不同。许多研究单方面针对酱油或食醋的挥发性风味成分或非挥发的呈味物质,或是仅对酱油或食醋的风味贡献较大的几种物质进行测定。本研究依据代谢组学的研究方法,采用气相色谱串联离子迁移谱和超高效液相色谱串联二级质谱对酱油和食醋的挥发性组分和非挥发性组分进行分析,利用多元统计分析寻找不同酱油、不同食醋之间的差异性代谢物。最后,以挥发性差异代谢物和非挥发性差异代谢物作为依据,对不同酱油、不同食醋的成分差异做出综合的分析和评价。本研究主要分为四个部分,第一部分为基于气相-离子迁移谱（GC-IMS）对酱油中挥发性风味物质的分析,采用气相-离子迁移谱对酱油样品进行检测,应用多元统计分析对不同酱油进行区分,可以良好区分的样品组进一步寻找挥发性差异性代谢物,并用仪器自带的软件制作的指纹图谱加以证明。第二部分为基于超高效液相色谱串联二级质谱（UPLCMS/MS）对酱油的代谢物的分析,这一部分主要是对酱油的非挥发性代谢物进行分析,采用超高效液相色谱串联二级质谱对酱油样品进行检测,应用多元统计分析对不同的酱油进行区分,原始数据在Compound Discoverer软件中进行分析并筛选出差异代谢物。第三部分为基于气相-离子迁移谱对食醋中挥发性风味物质的分析,第四部分为基于超高效液相色谱串联二级质谱对食醋的代谢物的分析,这两部分的研究流程分别与第一、二部分的研究流程基本相同。第一、二部分的研究对不同的酱油中的挥发性物质和非挥发性物质进行了分析。品牌酱油与散装酱油比较,品牌酱油具有更丰富的的挥发性化合物和非挥发性化合物含量,包括丰富的烟熏香、香蕉和奶酪香、咖啡和可可香等风味物质和氨基酸类物质,散装酱油含有高含量的糠醛。特级酱油和三级酱油相比,挥发性成分无显著差异,非挥发性成分差异较小,特级酱油的非挥发性成分相对较丰富。特级酱油和散装酱油相比,特级酱油含有更丰富的的氨基酸类物质、生物活性物质等非挥发性成分。三级酱油和散装酱油相比,三级酱油含有丰富的烟熏香、香蕉和奶酪香、咖啡和可可香等风味物质和营养物质（氨基酸类物质、生物活性成分等）,散装酱油糠醛含量很高而营养物质较少。第三、四部分的研究对不同的食醋中的挥发性物质和非挥发性物质进行了分析。瓶装食醋和袋装食醋之间在挥发性成分和非挥发性成分上都有差异,但这些差异性代谢物在组内不同样品之间分布也不均匀,显示出与品牌之间存在关联。在产地的比较中,山东产食醋与山西产食醋的挥发性成分无明显差异,两组的非挥发性成分差异也很小。山东产食醋和江苏产食醋的挥发性成分无明显差异,江苏产食醋的氨基酸类物质、生物活性成分等非挥发性物质更丰富。山西产食醋和江苏产食醋比较,江苏产食醋无论在挥发性成分还是非挥发性成分上都更加丰富。气相-离子迁移谱检测得的物质为挥发性成分,主要是醇类、醛类、酮类、杂环类和酯类等化合物。超高效液相色谱串联二级质谱检测得的物质几乎都是非挥发性成分,主要有氨基酸类、生物活性成分、合成药物成分和农药等。虽然两种分析方法检测到的物质不同,但是相同的样品组在两种分析方法中基本呈现出相似的品质特征。本研究从挥发性成分和非挥发性成分两个方面分析了不同的酱油和食醋的差异,对酱油和食醋进行综合评价,为酱油和食醋的风味研究、品种鉴别、品质评价等提供依据,同时为酱油和食醋的风味分析提供了一个新思路。

关键词：酱油食醋气相-离子迁移谱差异性代谢物代谢组学

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马尾松花粉提取物对前列腺肥大小鼠的影响

马尾松花粉提取物对前列腺肥大小鼠的影响

作者：马玉山东师范大学

学位级别：硕士

前列腺肥大(BPH)是老年男性的常见疾病，为患者的身体和心灵造成了很大的损害。目前治疗BPH的主流药物为5α-还原酶抑制剂和α1-肾上腺素受体阻滞剂，但它们均存在一定的副作用。马尾松花粉提取物(MPPE)是一种具有良好的抗炎和抗氧化活... 详细信息

前列腺肥大(BPH)是老年男性的常见疾病，为患者的身体和心灵造成了很大的损害。目前治疗BPH的主流药物为5α-还原酶抑制剂和α1-肾上腺素受体阻滞剂，但它们均存在一定的副作用。马尾松花粉提取物(MPPE)是一种具有良好的抗炎和抗氧化活性的天然植物提取物，其营养丰富，无毒副作用。很多研究表明，MPPE可用于改善BPH。本实验拟采用腹腔注射丙酸睾酮（5mg/kg·d）的方法建立小鼠BPH模型，通过探究MPPE以及SQ、PGY两种复方对小鼠BPH的影响，为松花粉进一步开发为抗BPH药物或保健品提供理论依据。实验包括以下几部分：第一，MPPE对小鼠BPH的预防作用探究：实验周期为6周，前两周三个松花粉组小鼠预先灌胃相应剂量的MPPE。后四周，在腹腔注射丙酸睾酮建立BPH模型的同时给予三种不同剂量（20、40、80mg/kg）的MPPE。实验结束时收集小鼠尿液，进行代谢组学分析，然后处死小鼠收集血清测定相关生理指标，剖取前列腺制作石蜡切片，观察组织形态变化。结果显示，与空白组相比，模型组小鼠的前列腺重量、前列腺指数显著增加，前列腺上皮细胞增生，向腺腔内折叠呈绒毛状，形态结构具有明显的BPH特征。三种剂量的MPPE作用效果有一定差异。与模型组相比，20mg/kg MPPE保护作用较小，而40、80mg/kgMPPE组的前列腺指数、炎性细胞因子含量、DHT浓度及PACP、NOS的活性均有明显的降低，NO的生成也相应减少。其中，80mg/kg的MPPE效果最好。PLS-DA结果与生化指标基本一致，对照组与模型组小鼠完全分开，说明BPH小鼠的尿液代谢物发生了明显的变化。非那雄胺组最接近空白组，MPPE的保护作用比较明显，但并未使小鼠完全恢复健康。第二，MPPE对小鼠BPH的治疗作用探究：与预防作用部分实验不同的是，治疗作用实验先腹腔注射丙酸睾酮4周建立BPH模型。然后再分别灌胃不同浓度的MPPE治疗4周。结果显示，模型组小鼠的前列腺重量、前列腺指数显著增加，前列腺组织形态具有明显的BPH特征。20mg/kg MPPE作用较小，80mg/kg的MPPE效果最好。BPH小鼠的尿液代谢物发生了明显的变化，MPPE作用效果比较明显，但并未使小鼠完全恢复健康。非那雄胺对BPH的改善效果最佳。另外，对PI百分抑制率进行对比，预防试验中三个剂量MPPE的抑制率分别为26.09%、52.17%、69.57%，而治疗实验的则分别为33.33%、57.14%、76.19%，可以看出MPPE对BPH的预防作用优于其治疗作用。第三，MPPE及SQ、PGY复方对小鼠BPH的影响：实验具体步骤与MPPE治疗作用实验一致，1-4周：建模;5-8周：治疗。实验结束后测定相关指标。实验结果显示，SQ、PGY两个复方的抗BPH活性明显优于MPPE。且SQ的效果比PGY稍好，但两者差异没有统计学意义。以上结果表明，（1）MPPE对BPH的预防作用优于其治疗作用，推测可能的原因是因为一边建模一边给药，MPPE及时的发挥了保护作用，减少了小鼠患BPH的可能;（2）SQ、PGY复方的效果优于MPPE，且SQ的效果比PGY稍好。说明SQ、PGY两种中草药与MPPE复合后可以起到一定的强化作用，能更好的改善BPH病症，对机体产生显著的保护作用;（3）MPPE可以降低BPH病理症状及相关生化指标，调节标志性代谢物的水平，且具有一定的剂量依赖性，MPPE的抗BPH作用机理可能与其抗炎抗氧化活性有关。

关键词：马尾松花粉提取物良性前列腺肥大代谢组学炎症氧化应激

柄海鞘（Styela clava）生物碱类物质的分离纯化及抗肿瘤活性研究

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柄海鞘（Styela clava）生物碱类物质的分离纯化及抗肿瘤活性研究

作者：张晾山东师范大学

学位级别：硕士

目前,国外对海洋被囊动物海鞘类生理活性物质的研究正处于高速发展阶段,但是关于从柄海鞘的鞘囊或鞘体中提取出高效的抗肿瘤药物的研究至今尚未见报道。国内学者对海鞘的研究仅有零星报道,多数未涉及到生理活性问题。我国海鞘资源丰富,... 详细信息

目前,国外对海洋被囊动物海鞘类生理活性物质的研究正处于高速发展阶段,但是关于从柄海鞘的鞘囊或鞘体中提取出高效的抗肿瘤药物的研究至今尚未见报道。国内学者对海鞘的研究仅有零星报道,多数未涉及到生理活性问题。我国海鞘资源丰富,种类多分布广,山东沿海柄海鞘资源极为丰富,与国外相比,国内海鞘资源不仅没有得到有效的开发,而且困扰着渔业和航海业的发展,应当引起人们的极大关注。本文从以下几方面对柄海鞘鞘体内生物碱进行了初步研究。首先,将采集到的新鲜柄海鞘冷冻保存,解冻后剥离鞘囊,将鞘体组织匀浆,冷冻干燥,将鞘体粉末用氨水湿润,氯仿浸提,浓缩氯仿浸提液,用盐酸酸化后乙醚萃取除掉脂溶性杂质,氢氧化钠碱化后用氯仿重新萃取,得到橙黄色的氯仿萃取液,浓缩蒸干得到脂溶性总生物碱。用10%氨水浸提鞘体残渣,盐酸酸化后,离心弃沉淀,向酸化溶液中加入饱和雷氏铵盐溶液,离心弃上清,丙酮溶解雷氏生物碱复盐沉淀,水洗重新沉淀。丙酮溶解沉淀后过732强酸H型阳离子交换树脂,10%氨水洗脱,浓缩蒸干洗脱液,盐酸酸化后过Sephadex LH-20凝胶柱层析,收集合并各组分。用半制备HPLC、结晶和重结晶、Sephadex LH-20,得到物质B-a、C-a、E-a。其次,对分离到的B-a用EI源质谱分析测试,由于尚含有杂质,无法确定B-a的具体结构;结合C-a的ESI源质谱、红外和X-单晶

关键词：柄海鞘生物碱 HPLC X-单晶衍射抗肿瘤活性