检索结果-南通市图书馆

作者：杜小芳华中科技大学

学位级别：硕士

1.研究目的探讨糖皮质激素对新生小鼠始基卵泡池形成及早期卵泡发育的影响。 2.研究方法实验采用健康成年C57BL/6小鼠24只按雄雌比例1:3合笼所生的新生雌鼠。按药物注射时间的不同分为四个大组，各组均包含地塞米松（DEX）注射组和生... 详细信息

1.研究目的探讨糖皮质激素对新生小鼠始基卵泡池形成及早期卵泡发育的影响。 2.研究方法实验采用健康成年C57BL/6小鼠24只按雄雌比例1:3合笼所生的新生雌鼠。按药物注射时间的不同分为四个大组，各组均包含地塞米松（DEX）注射组和生理盐水对照组（CON）。因不同笼小鼠在出生时间上可能存在若干小时的差异，为求结果准确可靠，各大组内DEX与CON两亚组之间均采用同笼对照。第一组：DEX(d1,3,5)表示出生后第1天、第3天、第5天注射地塞米松组。CON(d1,3,5)表示出生后第1天、第3天、第5天注射生理盐水组。第二组：DEX(d1)表示出生后第1天注射地塞米松组。CON(d1)表示出生后第1天注射生理盐水组。第三组：DEX(d3)表示出生后第3天注射地塞米松组。CON(d3)表示出生后第3天注射生理盐水组。第四组：DEX(d5)表示出生后第5天注射地塞米松组。CON(d5)表示出生后第5天注射生理盐水组。药物注射剂量：10mg/kg;各组小鼠均于生后第七天（此时始基卵泡池已完全形成）处死，并收集双侧卵巢，左侧卵巢做组织切片，经HE染色后观察小鼠始基卵泡池形成情况和不同发育阶段卵泡数目和比例。 3.实验结果第一组DEX(d1,3,5)与CON(d1,3,5)相比，始基卵泡池规模缩小，始基卵泡数目及所占比例减少，而初级卵泡和次级卵泡数目和比例较多，差异有显著性（P<0.05）。第二组DEX(d1)与CON(d1)相比，始基卵泡池规模缩小，始基卵泡数目和比例减少，初级卵泡比例升高，差异有显著性（P<0.05）;然而初级卵泡数目、次级卵泡数目和次级卵泡比例无显著性差异。第三组DEX(d3)与CON(d3)相比，各级卵泡数目和比例均无显著性差异。第四组DEX(d5)与CON(d5)相比，各级卵泡数目和比例也无显著性差异。 4.结论大剂量糖皮质激素的早期应用可能影响始基卵泡的形成进而损害卵巢寿命，而且该损害作用与激素暴露的时间窗和累积剂量相关。小鼠出生后第一天是生殖细胞巢破裂时期，此时暴露于大量糖皮质激素，损害作用尤其明显，能显著缩小始基卵泡池规模，可能有害于卵巢的生殖寿命和内分泌功能。而且，若在始基卵泡池形成阶段多次或者长期应用糖皮质激素，除可直接导致始基卵泡生成减少外，亦可促进始基卵泡的起始募集和发育，加速卵泡消耗，进一步缩小始基卵泡池的规模。

关键词：新生小鼠糖皮质激素始基卵泡池卵泡发育

雌性生殖干细胞卵巢内移植修复化疗导致的卵巢性不孕

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雌性生殖干细胞卵巢内移植修复化疗导致的卵巢性不孕

作者：熊家强华中科技大学

学位级别：硕士

女性癌症患者中,因化疗损伤卵巢而导致的过早闭经以及不孕是很常见的现象。对于这些病人来说,化疗前成熟卵子/胚胎或者卵巢组织冰冻保存是她们保存生育能力的主要选择。但是,对于她们卵巢功能的长期保护,尤其是生育能力的保存,以上方法... 详细信息

女性癌症患者中,因化疗损伤卵巢而导致的过早闭经以及不孕是很常见的现象。对于这些病人来说,化疗前成熟卵子/胚胎或者卵巢组织冰冻保存是她们保存生育能力的主要选择。但是,对于她们卵巢功能的长期保护,尤其是生育能力的保存,以上方法是有局限性的。青春前期的女性由于卵巢功能尚未成熟,所以无法进行成熟卵子或胚胎冻存;对于未婚的成年女性,胚胎冻存则需要捐献者的精子,且卵子或胚胎冻存,都需要药物促排卵操作,这个操作过程不仅耽误癌症的治疗时间,同时也可能使雌激素敏感性癌进一步发展。目前卵巢组织冰冻保存还处于实验阶段,且化疗后再移植还存在引起癌症复发的可能。因此,对于很多化疗后获得长期生存的不孕女性来说,寻找一种经济、持久、安全及可靠的方法来挽救他们的卵巢功能及生育能力是社会急需解决的一项大事。2009年Zou等首次从小鼠卵巢中分离得到雌性生殖干细胞,并证实了该干细胞在体内可以形成卵子并产生后代,从而首次真正意义上的证实了哺乳动物卵巢中存在生殖干细胞。2012年White等在验证了Zou等实验基础上同时首次从育龄期妇女卵巢中分离得到女性生殖干细胞。以上实验结果将为运用雌性生殖干细胞治疗女性不孕甚至延缓卵巢衰老提供理论基础。考虑到现实中已经有成千上万的年轻女性患者因化疗而导致卵巢功能受损甚至不孕,本研究通过化疗诱导雌性小鼠卵巢性不孕来模拟女性患者化疗后卵巢性不孕,探讨雌性不孕小鼠卵巢内是否存在生殖干细胞以及用此干细胞移植能否挽救因化疗导致的卵巢功能受损及不孕。我们成功的从化疗后不孕小鼠卵巢内分离得到了生殖干细胞,并通过RT-PCR,免疫荧光,碱性磷酸酶染色以及核型分析等多方面鉴定该细胞的特性;功能方面,利用GFP慢病毒转染干细胞并移植到化疗不孕小鼠卵巢内,小鼠生育能力得到恢复并产生后代;通过PCR和Southern blot鉴定鼠尾基因组DNA中的GFP基因,证实了GFP转基因鼠是来源于生殖干细胞分化后受精而产生的。本实验首次证实了化疗后不孕小鼠卵巢内存在雌性生殖干细胞,且该干细胞卵巢移植后可以修复卵巢功能以及生育能力,这为临床上化疗后卵巢功能受损以及不孕病人利用自身生殖干细胞进行自体移植治疗提供了一定的理论基础及参考价值,为新的治疗方案带来希望。

关键词：雌性生殖干细胞化疗不孕卵巢功能干细胞移植

母体长期日常剂量对羟基苯甲酸丙酯暴露对子代小鼠卵泡发育的影响及机制研究

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母体长期日常剂量对羟基苯甲酸丙酯暴露对子代小鼠卵泡发育的影响...

作者：郭清纯华中科技大学

学位级别：硕士

研究目的探究母体长期日常剂量对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben,PrPB)暴露对子代小鼠卵泡发育的影响及机制探索。研究方法动物实验:模拟人群的PrPB日常暴露剂量,对6周龄的C57BL/6j雌性小鼠进行随机分组,包括空白对照组(Control)、低剂量... 详细信息

研究目的探究母体长期日常剂量对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben,PrPB)暴露对子代小鼠卵泡发育的影响及机制探索。研究方法动物实验:模拟人群的PrPB日常暴露剂量,对6周龄的C57BL/6j雌性小鼠进行随机分组,包括空白对照组(Control)、低剂量PrPB暴露组(7.5 mg·kg bw·d,相当于人体平均日常暴露剂量)及高剂量PrPB暴露组(90 mg·kg bw·d,相当于目前报道的人体暴露的最大安全剂量)。运用饲喂法进行长期PrPB暴露,小鼠12周龄时进行合笼交配,在孕期及哺乳期持续PrPB暴露,直至出生后3周子代小鼠离乳。监测子代小鼠体重,在子代小鼠9周龄(性成熟期)和36周龄(卵巢功能加速衰退期)时监测其动情周期,检测其血清性激素水平,并收集子代雌性小鼠卵巢固定包埋切片,对其进行HE染色并进行卵泡计数,来评价雌性子代卵巢的生殖内分泌功能及卵巢储备功能。同时,对子代雌性小鼠的卵巢切片进行免疫组织化学染色和Western Blot实验检测自噬及凋亡相关蛋白的表达(LC3B、p62、Beclin-1、Bax、Caspase3等),探索PrPB影响卵巢功能的可能机制。细胞实验:选择25-28天雌性C57BL/6j小鼠,采用机械分离法采集小鼠的卵巢颗粒细胞。梯度PrPB浓度干预颗粒细胞观察其生长状态,绘制颗粒细胞的生长曲线。参考文献并结合本实验中颗粒细胞的生长状态,后续细胞实验分为DMSO对照组、50μM组及100μM组。利用流式细胞凋亡检测、Ed U细胞增殖检测、免疫印迹等方法进行机制探讨,进一步研究PrPB对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及自噬水平的影响及其分子机制。用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)干预颗粒细胞,探究3-MA是否能逆转PrPB促进颗粒细胞自噬的效应。研究结果(1)PrPB暴露组子代小鼠出生体重下降,离乳后各组之间体重无显著统计学差异,表明母体长期日常剂量PrPB的暴露可能影响胚胎的正常发育。(2)长期PrPB暴露影响子代小鼠卵巢内分泌功能,PrPB暴露组小鼠动情周期紊乱的比例明显增加。(3)PrPB暴露组小鼠卵巢的窦卵泡数下降(p<0.05),提示母体长期日常剂量的PrPB暴露会影响子代雌性小鼠的卵巢储备。(4)免疫组化实验及Western Blot实验显示,PrPB暴露组的子代小鼠卵巢中Beclin1表达水平和LC3B-II/LC3B-I比值均上升、P62蛋白表达水平下降、卵巢中促凋亡蛋白Bax表达上调(p<0.05),提示PrPB暴露导致了小鼠卵巢中细胞自噬和凋亡水平的增强。(5)PrPB干预影响体外原代小鼠颗粒细胞的生长状态,使颗粒细胞增殖活性降低。(6)PrPB干预后,体外小鼠原代颗粒细胞中自噬相关蛋白Beclin1表达水平升高、P62表达水平降低,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表达增加,表明PrPB的体外干预可能导致小鼠颗粒细胞的自噬和凋亡水平升高。(7)自噬抑制剂3-MA处理使PrPB干预组颗粒细胞自噬水平降低,进一步提示PrPB能够导致颗粒细胞过度自噬,抑制自噬可以改善PrPB对颗粒细胞的损伤效应。研究结论雌鼠长期日常剂量暴露于对羟基苯甲酸丙酯,与正常未暴露的适龄雄鼠交配产下的小鼠出生体重降低,且雌性仔鼠卵巢生殖内分泌功能下降及卵泡发育异常。研究提示PrPB可能通过诱导卵巢颗粒细胞自噬及凋亡水平增加,导致卵泡发育异常、卵巢储备减少,进而影响子代雌性小鼠的卵巢生殖内分泌功能。

关键词：对羟基苯甲酸丙酯环境内分泌干扰物卵巢储备生殖内分泌

CD44v6和LYVE-1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达和意义及雌孕、激素对CD44v6mRNA表达影响

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CD44v6和LYVE-1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达和意义及雌孕、激素...

作者：陈睿华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分CD44v6和LYVE-1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达摘要目的:探讨CD44v6和LYVE-1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义。方法:应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法检测CD44v6、和LYVE-1在63例卵巢上皮性癌、5例卵... 详细信息

第一部分CD44v6和LYVE-1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达摘要目的:探讨CD44v6和LYVE-1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义。方法:应用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法检测CD44v6、和LYVE-1在63例卵巢上皮性癌、5例卵巢良性上皮性肿瘤和4例正常卵巢组织中的表达情况。结果:正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤和卵巢上皮性癌中CD44v6和LYVE-1蛋白的表达具有显著差异;CD44v6表达强度与卵巢癌临床分期和组织学分级呈正相关,LYVE-1的表达和卵巢癌的临床分期正相关,而不同组织学分级间差异无显著性;CD44v6和LYVE-1的表达强度与淋巴结有无转移显著相关;CD44v6和LYVE-1在卵巢癌中协同表达。结论:CD44v6和LYVE-1在卵巢癌发生发展、和淋巴转移中起不同程度的作用,其检测可为卵巢肿瘤生物学行为判定提供参考依据。第二部分雌孕激素对乳腺癌细胞CD44v6mRNA表达的影响摘要目的:探讨17β-雌二醇(17β-E2)、醋酸甲羟孕酮(MPA)对乳腺癌细胞株CD44v6 mRNA表达的影响。方法:采用10-12,10-11,10-10,10-9,10-8mol/l17β-E2或10-9,10-8,10-7,10-6,10-5mol/lMPA作用于乳腺癌细胞株MCF-7细胞后,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MCF-7细胞CD44v6 mRNA水平的变化。结果:10-12-10-8mol/l17β-E2浓度的增加,MCF-7细胞CD44v6 mRNA表达呈递增趋势;10-11-10-8mol/l17β-E2组与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。随着10-9-10-5mol/lMPA浓度的增加,MCF-7细胞CD44v6 mRNA表达呈下降趋势,MPA各组与对照组比较,差异有显著性(P<0.05)。结论:雌激素可上调MCF-7细胞的CD44v6 mRNA水平的表达:孕激素可下调MCF-7细胞的CD44v6 mRNA水平的表达。

关键词：卵巢上皮性肿瘤 CD44v6 LYVE-1 免疫组织化学乳腺癌雌激素孕激素

宫颈癌血浆标志物microRNAs辅助诊断作用

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宫颈癌血浆标志物microRNAs辅助诊断作用

作者：王琳华中科技大学

学位级别：硕士

背景:宫颈癌是女性常见肿瘤之一,发病在全球趋于年轻化。缺乏有效的非侵入性血液生物标志物预警分子用于临床宫颈癌筛查。外周血血浆或者血清micro RNAs,被用于多种恶性肿瘤诊断和预后评估,说明micro RNA作为恶性肿瘤标志物具有可行性... 详细信息

背景:宫颈癌是女性常见肿瘤之一,发病在全球趋于年轻化。缺乏有效的非侵入性血液生物标志物预警分子用于临床宫颈癌筛查。外周血血浆或者血清micro RNAs,被用于多种恶性肿瘤诊断和预后评估,说明micro RNA作为恶性肿瘤标志物具有可行性。宫颈癌亟需血浆生物标志物辅助临床筛查或诊断。本研究提出假设,宫颈癌血浆中是否存在micro RNAs标志物,能否筛选出早期宫颈癌血浆micro RNAs标志物,血浆micro RNAs是否能作为早期宫颈癌的非侵入性生物标志物,辅助临床,诊断宫颈癌。方法:该研究招募了261名参与者。中重度宫颈上皮内瘤变(CINII,CINIII)52例,宫颈癌58例,健康者151例。初步筛选阶段,实行micro RNA Taq Man低密度阵列(TLDA)芯片液体测序,于16例血浆样本(宫颈癌8例、健康者血浆8例)中筛选差异表达micro RNAs;第二步验证阶段,运用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)实验技术于100例血浆样本(CINII、CINIII、宫颈癌共50例为病例组,健康者血浆50例为对照组)评估第一步筛选的差异micro RNAs位点。第三步验证阶段,于145例样本(52例为病例组、93例为对照组)进一步验证差异位点,t检验评估统计学差异,ROC(the receiver operating characteristic curve)曲线下面积评估该位点诊断宫颈癌前病变、宫颈癌特异性和敏感性。结果:1.本研究共招募符合标准研究对象261名参与者,包括CINII和CINIII 52例,宫颈癌58例,健康者151例。2.病例组年龄与对照组年龄无明显统计学差异(p≥0.05)。3.本研究发现hsa-mir-e在宫颈癌、CINII和CINIII血浆中表达水平显著高于健康者血浆中表达水平,具有明显统计学差异p2.0。***-mir-e在宫颈癌与健康者之间具有一定诊断意义(AUC>0.7且p0.7且p0.05)。结论:has-mir-e在宫颈癌与健康者之间,CINII/CINIII与健康者之间具有辅助诊断意义,可作为宫颈癌有效的、简单的,非侵入性生物标记物,但在宫颈癌发生发展作用机制尚需进一步研究。

关键词：宫颈癌中度宫颈上皮内瘤变重度宫颈上皮内瘤变 microRNA 血浆生物标志物筛选

Twist-1介导的衰老阻滞在宫颈癌发生与发展中的作用机理

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Twist-1介导的衰老阻滞在宫颈癌发生与发展中的作用机理

作者：陶涛华中科技大学

学位级别：硕士

【目的】应用免疫组化法,通过对128例临床标本中Twist-1分子的表达水平的检测来研究Twist-1基因介导的衰老阻滞在宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）到宫颈癌发生及其发展过程中所发挥的作用。【方法】 1... 详细信息

【目的】应用免疫组化法,通过对128例临床标本中Twist-1分子的表达水平的检测来研究Twist-1基因介导的衰老阻滞在宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithelial neoplasia,CIN）到宫颈癌发生及其发展过程中所发挥的作用。【方法】 1.收集128例临床标本,其中正常宫颈组织14例,CINⅠ～CINⅡ级30例,CINⅢ级14例,宫颈癌70例,分以上四组进行检测;2.采用免疫组化（SABC法）的方法检测各分组中Twist-1和CBX-3的表达情况;3.应用特异性Twist-1小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）靶向下调宫颈癌细胞系SIHA细胞中的Twist-1基因,半乳糖苷酶染色法检测Twist-1表达下调后SIHA细胞的衰老情况。【结果】 1.由正常宫颈组织到宫颈癌的演变过程中,宫颈细胞中Twist-1分子的表达水平逐渐增强;2. CBX-3的表达水平随着CIN程度的加深而增加,在CINⅢ期CBX-3的表达水平达到峰值,进展到宫颈癌时其表达水平又明显减弱;3.体外SIHA细胞实验中证实,下调Twist-1分子的基因表达水平可以诱导宫颈癌细胞系SIHA细胞出现衰老。【结论】Twist-1分子介导的衰老阻滞在宫颈癌的癌前病变中起到了抑制宫颈癌发生的作用。

关键词：宫颈癌 Twist-1 衰老 CBX-3 癌症发生

紫杉醇发挥抗癌效应的浓度依赖机制及其与Bub1的相关性研究

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紫杉醇发挥抗癌效应的浓度依赖机制及其与Bub1的相关性研究

作者：王丽华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分:紫杉醇对卵巢癌细胞的作用及其浓度依赖机制探讨目的探讨不同浓度紫杉醇对卵巢癌细胞发挥抗癌效应的机制以及紫杉醇诱导G2/M期阻滞与纺锤体检测点蛋白Bub1的相关性。方法以50、10、1、0.1、0.01uM紫杉醇作用于人卵巢癌细胞系A... 详细信息

第一部分:紫杉醇对卵巢癌细胞的作用及其浓度依赖机制探讨目的探讨不同浓度紫杉醇对卵巢癌细胞发挥抗癌效应的机制以及紫杉醇诱导G2/M期阻滞与纺锤体检测点蛋白Bub1的相关性。方法以50、10、1、0.1、0.01uM紫杉醇作用于人卵巢癌细胞系A2780,以未加药细胞作为对照组,采用流式细胞术检测不同浓度,不同时间紫杉醇作用下A2780细胞的周期分布变化情况。以50uM、1uM、0.01uM紫杉醇A2780细胞,作用时间依次为12、24、24小时,未加药细胞作为对照组,流式检测G2/M期阻滞情况,RT-PCR检测Bub1mRNA的表达差异;采用胸苷对A2780细胞进行同步化处理后,流式分析0.01uM紫杉醇对细胞周期的影响;Annexin V/PI双染流式细胞术分析50uM紫杉醇对细胞坏死的影响。结果(1)当紫杉醇浓度为10uM,1uM,0.1uM时,G2/M期细胞比例明显高于50uM(P<0.001),0.01uM组(P<0.001)。且1uM组阻滞可持续至72小时,50uM组36小时后即观察不到G2/M期阻滞,5nM组与未处理组相比始终未检测到G2/M期阻滞。(2)1uM处理组G2/M期细胞比例和Bub1mRNA的表达均明显高于另外两个浓度组和未处理细胞(3)A2780细胞经同步化处理后给予0.01uM紫杉醇,经过一个细胞倍增时间未观察到G0/G1期阻滞。(4)50uM处理组坏死细胞的比例明显高于1uM,0.01uM组,差异有统计学意义(P<0.001)。结论不同浓度紫杉醇发挥抗癌效应的机制不同,紫杉醇诱导G2/M期阻滞与纺锤体检测点Bub1的表达呈正相关。第二部分:紫杉醇发挥抗癌效应依赖于纺锤体检测点蛋白Bub1 目的探讨纺锤体检测点蛋白Bub1在紫杉醇诱导G2/M期阻滞和发挥抗癌效应中的作用。方法(1)以不同浓度紫杉醇分别作用于A2780和A2780/TS细胞,作用时间为24小时,采用流式细胞术分析细胞周期;通过MTT法检测细胞增殖情况,以1uM紫杉醇分别作用于A2780和A2780/TS细胞,作用时间为24,36,48小时,通过流式检测凋亡情况。(2)采用胸苷和紫杉醇分别将A2780和A2780/TS细胞阻滞在G1/S早期和G2/M期,A2780和A2780/TS作为配对细胞,采用western-blot比较两株细胞分别在对数生长期,G1/S期和G2/M期Bub1蛋白的表达差异。(3)构建Bub1的shRNA表达载体(Bub1-shRNA),采用RNA干扰技术封闭A2780细胞中Bub1的表达,运用RT-PCR和western-blot检测Bub1的封闭情况。(4) Bub1-shRNA瞬时转染A2780细胞,转染后给予紫杉醇,运用PI单染、流式分析细胞周期和中、晚期凋亡情况;Annexin V单染、流式分析早期凋亡情况;采用Hoechst 33342染色法检测有丝分裂指数。结果(1)A2780与A2780/TS细胞均在0.1-10uM的浓度范围内有高比例的G2/M期细胞含量,某些浓度下紫杉醇对前者诱导G2/M期阻滞的作用要强于后者(P1uM=0.045, P10uM=0.036)。MTT法检测和流式分析均证实A2780细胞对紫杉醇的敏感性明显高于A2780/TS细胞,(P0.01uM、P0.1uM、P1uM<0.001,P10uM=0.021;P24h、P36h、P48h<0.001)(2)A2780和A2780/TS细胞经1uM紫杉醇处理后,G2/M期细胞的比例和Bub1的表达均明显高于对照细胞。(3)在对数生长期,G1/S期和G2/M期,A2780细胞Bub1蛋白的表达均高于A2780/TS细胞。(4)RT-PCR,western-blot均显示转染Bub1-shRNA后,A2780细胞中Bub1蛋白的表达明显下调。(5)封闭A2780细胞Bub1的表达后,有丝分裂指数降低(p=0.022);G2/M期细胞比例减少,G0-G1期和S期细胞比例升高(PG2/M=0.018,PG0-G1=0.041,PS=0.024);紫杉醇诱导中、晚期凋亡的效应明显减弱(p=0.027),紫杉醇诱导早期凋亡的效应并不受影响(p=0.236);紫杉醇对A2780细胞的增殖抑制率明显减弱(P0.1uM=0.037,P1uM =0.041,P10uM=0.029)。结论紫杉醇通过Bub1相关纺锤体检测点信号通路诱导G2/M期阻滞;Bub1表达的下调可以导致紫杉醇耐药。

关键词：卵巢癌紫杉醇周期阻滞细胞坏死纺锤体检测点蛋白Bub1 G2/M期阻滞凋亡

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HPV16型E7与EMT之间关系的研究

HPV16型E7与EMT之间关系的研究

作者：杨润峰华中科技大学

学位级别：硕士

【目的】将真核表达质粒psilencer2.1-U6-hyg-shE7和pcDNA3.1-E7分别导入宫颈癌细胞株SiHa、C33a，人为改变两种细胞株中HPV16型E7基因的表达，通过对照研究揭示E7基因表达的变化与EMT之间的关系。【方法】利用已构建的真核表达质... 详细信息

【目的】将真核表达质粒psilencer2.1-U6-hyg-shE7和pcDNA3.1-E7分别导入宫颈癌细胞株SiHa、C33a，人为改变两种细胞株中HPV16型E7基因的表达，通过对照研究揭示E7基因表达的变化与EMT之间的关系。【方法】利用已构建的真核表达质粒psilencer2.1-U6-hyg-shE7与pcDNA3.1-E7，分别转染宫颈癌细胞株SiHa、C33a，然后用药物Hygromycin和G418在合适的浓度下筛选，获得能够稳定沉默或者稳定表达E7基因的细胞株SiHa-psilencer2.1-U6hygro、SiHa-psilencer2.1-U6hygro-shE7、C33a-pcDNA3.1（+）及C33a-pcDNA3.1（+）-E7;运用细胞划痕实验和transwell检测细胞系的迁移运动侵袭能力;利用Real-timePCR、Westernblot分别在RNA水平和蛋白水平检测E7基因表达变化与EMT指标之间的变化关系。【结果】 1.细胞划痕实验的结果显示：在SiHa-Blank、SiHa-vector及SiHa-shE7这三类细胞中，相对于空白对照和阴性对照来说，E7基因表达被沉默了的SiHa-shE7迁移运动能力明显降低（P＜0.05），差异具有统计学意义;另外，在C33a-Blank、C33a-vector及C33a-E7这三类细胞中，相对于空白对照和阴性对照来说，高表达E7基因的C33a-E7迁移运动能力明显升高（P＜0.01），差异具有统计学意义。 ***细胞体外侵袭实验发现，SiHa-Blank，SiHa-vector和SiHa-shE7的跨膜细胞数分别为99±3，92±5，70±4;C33a-Blank，C33a-vector和C33a-E7的跨膜细胞数分别为69±2，76±6，93±4。 ***-timePCR检测各个基因在RNA水平的表达发现，实验组HPV16-E7、E-cadherin、Vimentin相对于空白对照组及阴性对照组来说，差异有极为显著的统计学意义，P＜0.001，另外，N-cadherin、FN的相对变化也有统计学意义，P＜0.05;C33a组细胞表达量变化：实验组HPV16-E7、N-cadherin、Vimentin相对于空白对照组及阴性对照组来说，差异有极为显著的统计学意义，P＜0.001，另外，E-cadherin、FN的相对变化也有统计学意义，P＜0.05;***检测各个基因在蛋白水平的表达发现，SiHa-shE7与SiHa-Blank、SiHa-vector对比观察，HPV16-E7的沉默效应比较明显，同时可见其上皮性标志物E-cadherin表达上调，间质性标记物N-cadherin、Vimentin的表达量下调;C33a-Blank、C33a-vector中HPV16-E7的表达量很低，与C33a细胞株的特性一致（没有感染HPV的宫颈癌细胞株），同时可以观察到C33a-E7相对于C33a-blank、C33a-vector，上皮性标志物E-cadherin表达有明显的下降，间质性标记物N-cadherin的表达有显著的上调，但同样是间质性标记物的Vimentin表达量的变化不明显。【结论】在宫颈癌细胞系SiHa、C33a中，E7基因的高表达能够上调间质性标志物，下调上皮性标志物，从而促进上皮间质化过程。同样的，E7基因表达的沉默或缺失，可以引起上皮性标记物的上调，间质性标记物的下调，阻碍上皮间质化过程。

关键词：上皮间质转化 E7 宫颈癌细胞系

小鼠腔前卵泡体外培养体系二维法和三维法的比较

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小鼠腔前卵泡体外培养体系二维法和三维法的比较

作者：王毅华中科技大学

学位级别：硕士

目的比较小鼠腔前卵泡体外培养体系二维法及三维法，通过观察比较二维液滴法和三维海藻酸钠明胶法体外卵泡的存活及生长情况、产生激素能力及卵母细胞成熟情况，来选择优化的小鼠腔前卵泡体外生长培养体系。方法经机械法分离得到出生... 详细信息

目的比较小鼠腔前卵泡体外培养体系二维法及三维法，通过观察比较二维液滴法和三维海藻酸钠明胶法体外卵泡的存活及生长情况、产生激素能力及卵母细胞成熟情况，来选择优化的小鼠腔前卵泡体外生长培养体系。方法经机械法分离得到出生12-14天C57BL/6J小鼠的单个卵泡，选择直径在80-130μm的结构完整的腔前卵泡，分别使用二维96孔板液滴法和三维96孔板海藻酸钠明胶法体系进行体外培养，在添加了10%血清、5.5mg/mlPNa、ITS、5ng/mlEGF及100mIUr-FSH的a-MEM培养基中共培养7天。隔天1/2换液，并使用倒置显微镜及Image J软件拍照并测量卵泡直径，使用免疫荧光分析法检测换液培养基的激素浓度。结果二维液滴法和三维海藻酸钠明胶法两体系中，卵泡的生存率及闭锁率无统计学差异;二维液滴法中卵泡直径增长速度快于三维海藻酸钠明胶法体系，且差异从第3天开始出现（1.12±0.154:1.11±0.148），并逐渐增大至第7天的最大值;两体系中产生雌二醇浓度差异不明显;培养结束时，二维液滴法中卵泡的卵母细胞恢复减数分裂至MI期（61%：4%）、MII期（17%：8%）的比例大于三维法培养的卵泡。结论小鼠腔前卵泡体外培养体系中二维液滴法中卵泡的生长速度及卵母细胞恢复减数分裂成熟状况均优于三维海藻酸钠明胶法。因此，二维液滴法小鼠腔前卵泡体外培养体系更加有利于卵泡的生长发育及卵母细胞的成熟。

关键词：腔前卵泡体外培养小鼠

重组腺相关病毒-LIGHT对小鼠宫颈癌模型的治疗作用研究

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重组腺相关病毒-LIGHT对小鼠宫颈癌模型的治疗作用研究

作者：马衣努尔﹒买提托合提华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分（Part I）重组腺相关病毒-LIGHT对小鼠宫颈癌模型的治疗作用研究 [摘要]目的构建含肿瘤坏死因子超家族成员14（LIGHT）的重组腺相关病毒（rAAV-LIGHT）,探讨（rAAV-LIGHT）对TC-1细胞株所建立的小鼠宫颈癌模型的抑... 详细信息

第一部分（Part I）重组腺相关病毒-LIGHT对小鼠宫颈癌模型的治疗作用研究 [摘要]目的构建含肿瘤坏死因子超家族成员14（LIGHT）的重组腺相关病毒（rAAV-LIGHT）,探讨（rAAV-LIGHT）对TC-1细胞株所建立的小鼠宫颈癌模型的抑瘤效应的可行性。方法用基因重组方法构建含LIGHT全长的重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-LIGHT-hrGFP,磷酸钙沉淀法将腺相关病毒载体系统共转染入病毒包装细胞中,分别合成rAAV-LIGHT和rAAV-GFP。并用实时荧光定量PCR测病毒滴度。RT-PCR检测rAAV-LIGHT对TC-1细胞的转染效率。体外用淋巴毒性试验来检测LIGHT的免疫效应。小鼠细胞系TC-1（转染过E6E7RAS）用于建立小鼠宫颈癌模型。成瘤第3天对空白对照组（5只小鼠）,rAAV-GFP（5只小鼠）, rAAV-LIGHT（5只小鼠）组分别进行肌肉注射。观察其生物特性及用实时定量PCR检测肿瘤微环境中LIGHT和其他细胞因子的表达情况。观察rAAV-LIGHT的抑瘤效应。通过流式细胞仪和肿瘤组织H＆E染色、免疫组化检测小鼠淋巴细胞增值效应。结果成功构建并鉴定了rAAV-LIGHT和rAAV-GFP,滴度为2.5×1010 v.g/ml,转染效率为60%。SPSS13.0分析结果显示rAAV-LIGHT组肿瘤大小明显小于对照组及rAAV-GFP组（P=0.0055,P=0.029 P＜0.05）。对照组及rAAV-GFP组比较无明显统计学意义（P=0.115 P＞0.05）。结论rAAV-LIGHT可在小鼠宫颈癌模型逆转肿瘤生长。第二部分（Part 2）携带小鼠HVEM的重组腺相关病毒载体的构建及鉴定【摘要】目的克隆小鼠疱疹病毒侵入介体（HVEM）基因,构建其重组腺相关病毒载体,鉴定目的基因在真核细胞中表达,为免疫基因治疗奠定基础。方法用RT-PCR法从小鼠脾脏淋巴细胞克隆出全长HVEM基因,构建携带HVEM基因的穿梭质粒pAAV-IRES-HVEM-hrGFP和辅助质粒pAAV-RC,pHelper利用磷酸钙共沉淀法将穿梭质粒共转染入AAV-293细胞中,采用细胞内质粒DNA同源重组法构建重组腺相关病毒rAAV- HVEM。用氯仿-PEG8000法纯化病毒,实时荧光定量PCR测病毒滴度。RT-PCR检测rAAV- HVEM在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中的表达情况。结果成功构建组装重组小鼠HVEM腺相关病毒,纯化后病毒滴度为5×1010 v.g/mL,且在CHO转导细胞中能有效表达目的基因。结论构建的重组腺相关病毒载体rAAV-HVEM为组织工程相关细胞转基因构建及临床应用提供先进的载体系统。为今后进一步研究HVEM的功能及其应用奠定基础。

关键词：腺相关病毒 LIGHT 宫颈癌免疫治疗疱疹病毒侵入介体基因治疗