检索结果-南通市图书馆

作者：沈雄中国海洋大学

学位级别：硕士

海洋微藻是海洋生态系统中的最主要初级生产者,也是海洋生物资源的重要组成部分,具有种类多、数量大、繁殖快等特点,在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。同时,微藻本身营养丰富,富含人类必须的蛋白质,氨基酸、不... 详细信息

海洋微藻是海洋生态系统中的最主要初级生产者,也是海洋生物资源的重要组成部分,具有种类多、数量大、繁殖快等特点,在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。同时,微藻本身营养丰富,富含人类必须的蛋白质,氨基酸、不饱和脂肪酸、多糖、类胡萝卜素等生物活性物质,在基础生物学研究、水产养殖、新能源的开发、药物研制等领域具有重要开发价值。我国海洋微藻资源丰富,已记录的近2000种。近年来,随着陆地资源的衰竭,丰富的海洋微藻资源成了人们关注的热点,从海洋中获取更多高值的微藻品种成为一项重要的基础性工作。微藻的鉴定及分类是藻类研究的基础,也一直是较为困难的课题之一。传统的微藻鉴定方法主要依赖于显微镜对微藻形态结构的观察和一些藻体所固有的生理生化特性。但是对于微微型的藻类,其可以识别并用于描述和物种鉴定的形态学特征非常少,与近缘种之间的差异非常不明显。在普通光学显微镜下,很难确定其准确的分类地位。分子生物学方法由于操作容易和结果直接可靠,被广泛的用于微藻的分类鉴定和系统进化研究中。通过选择有代表性的序列片段作为分类标准,来区分不同生物间,同种生物种内株系之间的遗传差异就成为当前研究的主要方向,为微藻的鉴定工作提供了一个新的有效方法。通过涂平板的方法,从青岛近海分离得到一株海洋微藻。通过普通光学显微镜观察,同时结合扫描电子显微镜和透射电子显微镜进行制片观察,并测定其18S rRNA基因（rDNA）序列来确定其准确的分类地位。将获得的18S rDNA与GenBank上已经登录的序列进行BLAST比对,结果显示,其序列与微拟球藻属的一个种: Nannochloropsis gaditana完全一致。进化树分析显示,该藻株与所有的***株系聚为一支,而与其他的种区别开来。因此,推测该藻株可能为微拟球藻属的一个种: ***。 Hibberd（1981）确定了微拟球藻属的分类地位,目前命名的有7个种。该属主要分布于海洋环境中,淡水和半咸水中比较少见。由于其能积累较高水平的高不饱和脂肪酸而具有较好的工业应用前景,同时被广泛的作为能量食物用于育苗中。该属所有的种都很微小,长椭圆形,直径约2微米,在形态学特征上几乎没有区别。这些藻超微结构也非常简单,通过光学显微镜和电子显微镜也难以区别。其分类主要通过18S rDNA和ITS序列分析。本研究利用18S rDNA和ITS序列分析了分离自不同地方的6株微拟球藻,并分析了它们之间的亲缘关系。结果显示:所有的藻株的序列与NCBI登录的***一致,而与其他的种类区别开来,认为该六株藻为***的不同株系。ITS分析显示,编号为C146和编号为Cdl的亲缘关系较近,在全部613个碱基中,两者的碱基差异为零,为同一个序列。另外的四个株系的亲缘关系较近,与第一组拥有10个相同的变异位点。某些株系拥有一到两个个别差异位点,证实了ITS变异位点的丰富性。位于两个ITS区的5.8S区的总长度为160bp,在六个株系中没有变化,显示出其保守性。这六株微拟球藻中,两两之间核苷酸差异大小为0%-2.4%。根据前人的研究成果,这六个株系可能为微拟球藻的同一种的不同株系。故18S rDNA和ITS分析的结果是温和的。普通的光学显微镜,由于放大倍数和分辨率的限制,对于微拟球藻等微型,同时又不具有特征性的表面结构的藻类,很难准确鉴定。由于分子生物学分类方法是以核酸序列的差异为依据,而核酸序列遗传的稳定性非常高,几乎不受环境条件的影响,使得结果的准确性非常高。18S rDNA和ITS序列分析,为那些通过形态鉴定难以确定分类地位的微型海洋藻类进行分子鉴定提供了一种较好的方法。

关键词：海洋微藻分离鉴定 18S rDNA ITS 微拟球藻

环境因子对微拟球藻脂质代谢及其硫脂酶转录水平的影响

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环境因子对微拟球藻脂质代谢及其硫脂酶转录水平的影响

作者：王丽丽中国海洋大学

学位级别：硕士

随着人口的增长和世界经济的飞速发展,化石能源的消耗日益加剧。为解决由此带来的能源危机和环境问题,世界各国不得不加快开发化石能源的替代燃料。近年来,生物柴油做为一种清洁可再生能源受到越来越多的重视。生物柴油虽然优点众多,但... 详细信息

随着人口的增长和世界经济的飞速发展,化石能源的消耗日益加剧。为解决由此带来的能源危机和环境问题,世界各国不得不加快开发化石能源的替代燃料。近年来,生物柴油做为一种清洁可再生能源受到越来越多的重视。生物柴油虽然优点众多,但其传统原料可能会对农产品价格、粮食安全产生影响。因此,选择一种低廉的、安全的原料来生产生物柴油是发展的总趋势。微拟球藻(Nannochloropsis)属于真眼点藻纲(Eustigmatophyceae),是一类重要的单细胞经济微藻。它富含蛋白质、多不饱和脂肪酸、色素等高附加值产物,且光合效率高、环境适应性强,油脂含量可以达到细胞干重的30%,能够进行大规模培养,被认为是生产生物柴油颇具前景的原料。尽管微藻做为生物柴油的原料有其它原料不可比拟的优势,但天然微藻脂肪酸的饱和度和长度并不适合生物柴油的生产。近年来,通过改变培养基组成、控制培养条件以及基因工程法提高微藻油脂含量和脂肪酸质量成为生物柴油研究的热点。实验包括以下两个部分：第一部分：分析微拟球藻cDNA文库,从微拟球藻中分离出一条硫脂酶基因的cDNA全长,命名为NoTE。NoTE全长1,314 bp,编码437个氨基酸,蛋白质相对分子质量为55 kD。将该基因连接到原核表达载体pET-30a上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达进行功能的初步验证。实验结果显示,表达NoTE并未改变大肠杆菌的脂肪酸组成,但其C14:1、C16:0、C16:1、C18:1及总脂肪酸含量较不含重组质粒菌株分别提高了11%、18%、32%、49%和30%,证明克隆的硫脂酶基因能在大肠杆菌中表达并具有相应的酶活性。第二部分：探究了限氮、限磷及不同温度对NoTE转录水平及微拟球藻总脂含量、脂肪酸组成的影响。限氮处理组结果显示,NoTE转录水平及油脂含量随限氮时间的延长而提高;在对脂肪酸组成的影响上,氮缺乏可以抑制多不饱和脂肪酸的合成,促进饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的合成。限磷处理得到了与限氮处理相同的结论。温度处理组结果显示,随温度的提高NoTE转录水平逐步提高,在20℃时油脂含量最高,在实验温度范围内,高温促进饱和脂肪酸的合成。综上所述,本研究成功分离了微拟球藻一条硫脂酶基因,通过原核表达体系验证了其功能;进一步探索了环境因子对该基因转录水平以及对微拟球藻油脂含量和脂肪酸组成的影响。

关键词：生物柴油微拟球藻硫脂酶环境因子

温度和硅胁迫对三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）生长和脂肪酸组成的初步研究

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温度和硅胁迫对三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）生长和...

作者：潘瑾中国海洋大学

学位级别：硕士

多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)对人类的健康非常重要,尤其是EPA(eicosapentaenoic acid,20:5n3)和DHA(docosapentaenoic acid,22：6n3)。人类自身不能合成这些PUFAs,当外源食物提供足够的亚油酸(linoleic acid, LA)和a-亚麻酸(a-linolenic acid,ALA)能在体内合成少量的EPA和DHA,但远远不能满足自身需要。因此,日常摄入一定量的PUFAs能够补充人体自身合成的不足,对某些疾病起到明显的预防和治疗作用。PUFAs的主要来源是深海鱼油,但鱼类自身并不能合成PUFAs,主要是靠吞食海洋微藻在体内富集。海洋微藻是海洋食物链的初级生产者,能够从头合成PUFAs且含量较高,加之其脂肪酸组成稳定,不含胆固醇,没有难闻的鱼腥味和重金属元素污染等优点正逐渐成为鱼油的良好替代资源,具有巨大的开发潜力。本实验选取一株海洋硅藻三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)进行生长和脂肪酸组成的初步探讨,该实验主要由两个部分组成：第一部分是温度对三角褐指藻生长和脂肪酸组成的初步探讨。设定10、15、20、25、30℃五个温度组,每个温度组设三个重复,培养三角褐指藻至指数生长末期,结果表明三角褐指藻的生长随着温度的升高到达指数生长末期所需时间缩短;不同温度下三角褐指藻的主要脂肪酸为C14:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2、C20:5(EPA),总脂肪酸随着温度的升高依次呈现先升高后降低的趋势,在15℃时EPA占总脂肪酸的百分含量达到最高值25.71%;将在20℃条件下培养至指数生长末期的三角褐指藻迅速转移到4℃下培养,胁迫0,6,12,24h,与在不同温度下培养相比,脂肪酸种类减少,主要脂肪酸有C14:0、C16:0、C16:1、C18:1、C20:5(EPA),而EPA的相对百分含量最高可达30.86%。第二部分是硅胁迫对三角褐指藻生长和脂肪酸组成的初步探讨。用含有不同硅浓度(0、12、24、48、96和384μmol/L)的培养基对三角褐指藻进行培养,单因子方差分析表明藻细胞密度随着硅浓度的增加而增加,在硅浓度为96μmol/L时藻细胞密度达到最大值,其后反而下降。将此硅浓度下的三角褐指藻培养至指数生长期,硅胁迫时间设置6个时间段,分别为0、2h、6h、12h、24h和48h,结果显示,在6h、48h时EPA含量有所降低,而在限制2h,12h,24h有所增加,并在限制时间24h时达到最高值。

关键词：三角褐指藻脂肪酸 EPA 温度硅胁迫

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微拟球藻诱变育种及高脂藻株筛选方法研究

微拟球藻诱变育种及高脂藻株筛选方法研究

作者：曲晓梅中国海洋大学

学位级别：硕士

随着世界经济发展，化石能源消耗日益加剧，环境问题不断凸显。为推进经济社会可持续发展，必须加快转变发展方式、优化能源结构，开发资源节约、环境友好的新型能源。微藻是水域生态系统的初级生产者，具有种类繁多、结构简单、生长迅... 详细信息

随着世界经济发展，化石能源消耗日益加剧，环境问题不断凸显。为推进经济社会可持续发展，必须加快转变发展方式、优化能源结构，开发资源节约、环境友好的新型能源。微藻是水域生态系统的初级生产者，具有种类繁多、结构简单、生长迅速以及含油量高等特点，近年来，利用微藻制备生物柴油已成为全世界研究的焦点。但是，由于多方面原因，微藻制备生物柴油至今仍未能实现工业化生产，其制约因素之一是缺乏优良的种质资源。微拟球藻（Nannochloropsisoceanica）生长速度快、油脂含量高、抗逆性强，是极具开发潜力的优良藻种。本文以研究室保存的微拟球藻（***）藻种（编号为CS-179）为材料，经过分离纯化开展了诱变育种研究，得出以下结果： 1.研究了乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂精喹禾灵筛选高脂微藻的可行性，发现7.5mol/L精喹禾灵可抑制99.7%的微拟球藻生长，10mol/L精喹禾灵完全抑制微拟球藻生长，确定了其有效性。以7.5mol/L精喹禾灵筛选获得两个藻株KA1和KA2，经52天培养后，其总脂含量分别达干重的46.73%和38.60%，比出发藻株分别提高了29.02%和6.57%。KA1的比生长速率和终生物量与出发藻株无显著差异,但其油脂产率比出发藻株显著升高。 2.利用浓度为50mM的化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）对微拟球藻进行诱变处理，并用精喹禾灵作为筛选压进行高脂诱变藻株筛选，获得了KE75B1和KE10A1两个高脂藻株，其总脂含量分别占细胞干重的44.19%和43.51%，比出发藻株（总脂含量占细胞干重的39.34%）分别提高了12.35%和10.62%（P0.05），但也较出发藻株升高了10.78%，证明了该高通量筛选方法的可行性。综上所述，本研究证明了以甲基磺酸乙酯（EMS）进行高脂微拟球藻诱变育种的有效性，确定了精喹禾灵作为筛选压筛选高脂微拟球藻的可行性，探明了尼罗红微波助染高通量筛选高脂微拟球藻的基本条件，为发展微拟球藻诱变育种提供了参考。

关键词：微拟球藻 EMS 诱变精喹禾灵尼罗红微波助染总脂

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两株海洋微藻△5脂肪酸去饱和酶的基因克隆

两株海洋微藻△5脂肪酸去饱和酶的基因克隆

作者：石娟中国海洋大学

学位级别：硕士

微藻是海洋食物链的初级生产者，能够产生多不饱和脂肪酸(PUFAs)且含量较高。海藻以其脂肪酸组成稳定，不含胆固醇，没有难闻的鱼腥味和重金属元素污染等优点正逐渐成为鱼油的良好替代资源，具有巨大的开发潜力。近年来，随着基因工程... 详细信息

微藻是海洋食物链的初级生产者，能够产生多不饱和脂肪酸(PUFAs)且含量较高。海藻以其脂肪酸组成稳定，不含胆固醇，没有难闻的鱼腥味和重金属元素污染等优点正逐渐成为鱼油的良好替代资源，具有巨大的开发潜力。近年来，随着基因工程的发展，在调控PUFAs生物合成方面已经取得不少成果。脂肪酸去饱和酶的基因克隆与转基因技术已应用于微藻领域，在阐明微藻脂类随环境因子变化而变化的机理，改善藻细胞的PUFAs组成等方面显示出重大的理论和实践意义。但是目前的研究主要集中于几种模式蓝藻，对应用前景广阔的真核微藻研究较少。小新月菱形藻(Nitzschia closterium ***)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是两株富含EPA(二十碳五烯酸，20：5n3)的海洋单细胞硅藻，其EPA含量可达到总脂肪酸的30％。关于硅藻的EPA生成途径已有相关报道，其中△5脂肪酸去饱和酶催化脂肪酸链的△5位去饱和，这是EPA生成的关键步骤。本实验以这两株硅藻为研究材料，旨在克隆其△5去饱和酶基因，为深入探讨EPA的生物合成机制和培养富含EPA的优良藻种创造条件。首先，通过对已知去饱和酶进行生物信息学分析，在序列的保守位点设计一对简并引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，将大小合适(500～600bp)的片段克隆测序。测序结果显示该片段编码的氨基酸序列与其它△5去饱和酶具有一定的同源性，且含有去饱和酶极为保守的3个组氨酸簇中第2、3两个。根据这段序列，选用合适的限制性内切酶酶切藻的基因组，消化产生的片段在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子;另外设计一对与此序列两端互补的特异引物，以环状DNA为模板做反向PCR，向已知片段的上游及下游区域扩增，最终得到完整的基因序列。小新月菱形藻的△5脂肪酸去饱和酶基因全序列共1559bp，在第300～430位碱基之间有一个内含子(intron)，去除后剩余1428个碱基，可翻译为475个氨基酸残基。经分析发现存在去饱和酶的3个极为保守的组氨酸簇，分别为HDANH、HWTHH、QVEHH;具有4个明显的跨膜α螺旋区，分别位于130～146、150～171、305～325和333～351位氨基酸残基之间;在其N端存在一个保守的模体(motif)-HPGG，与其后同样保守的G、Y、H均属于“前端”去饱和酶(‘front end’desaturase)所共有的类细胞色素b结构域。该蛋白序列在NCBI(美国国家生物信息中心)网站的BLAST 两株海洋微藻△5脂肪酸去饱和酶的基因克隆中做蛋白一蛋白序列比较，结果与三角褐指藻的△5脂肪酸去饱和酶同源性最高，达到 52%。三角褐指藻的△5脂肪酸去饱和酶基因全序列共1520坤，发现在第304一413碱基处为一个内含子，除去后剩余1410个碱基，可翻译为469个氨基酸残基，与NCBI里发布的三角褐指藻△5脂肪酸去饱和酶的蛋白序列一致(序列号:AYo82392)。Domergue等已做过该蛋白的序列分析，同样存在3个保守的组氨酸簇、4个跨膜区和N端类细胞色素死结构域。本实验应用简并PCR结合反向PCR的方法，与克隆其它去饱和酶基因所常采用的构建并筛选cDNA文库相比，更为简便、经济、有效，成功的实现了微藻△5脂肪酸去饱和酶的基因克隆。据我们所知，到目前为止NCBI中还没有关于小新月菱形藻的任何序列发表，本工作第一次从该藻中克隆得到功能基因，为进一步开展该基因的表达调控及转基因研究奠定了基础。此外，小新月菱形藻的分类地位一直不是非常明确，有人认为它是三角褐指藻的另一种形式。现在从单种培养的小新月菱形藻中克隆得到了△5脂肪酸去饱和酶基因，由序列比较可知，它与三角褐指藻尽管同源性较高，但是并非完全一致，说明它们并不是同一个藻种。小新月菱形藻具体的分类地位还需其它实验确证。

关键词：小新月菱形藻三角褐指藻脂肪酸去饱和酶多不饱和脂肪酸

部分南海可培养微藻的分子鉴定及富油藻株的筛选

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部分南海可培养微藻的分子鉴定及富油藻株的筛选

作者：冯甜中国海洋大学

学位级别：硕士

南海水域辽阔，地质、气候等环境条件复杂，蕴含丰富的生物资源，是能源微藻资源库。本研究以从南海分离到的微藻细胞为对象，利用分子生物学手段进行分类鉴定，通过测定其生长指标及含油量，筛选出生长快速、油脂含量高的藻种，为微藻... 详细信息

南海水域辽阔，地质、气候等环境条件复杂，蕴含丰富的生物资源，是能源微藻资源库。本研究以从南海分离到的微藻细胞为对象，利用分子生物学手段进行分类鉴定，通过测定其生长指标及含油量，筛选出生长快速、油脂含量高的藻种，为微藻生物柴油的生产提供了更多的原材料。具体的工作内容和结果如下： 1.通过交互使用微吸管法、96孔板稀释法、水滴法、平板法，从141个水样中分离纯化出57株纯种微藻，获得了丰富的藻种资源。其中稀释法效果最好，但得到的藻种种类较单一，一般为优势藻种。 2.利用18S核糖体RNA基因(rDNA)对分离纯化得到的57株纯种藻细胞进行分子鉴定，共鉴定出11种不同种类的藻细胞，其中8种被鉴定到属，1种被鉴定到科，2种被鉴定到目。鉴定结果如下：1、5、7、11、21、29、59、72号藻株分别为Bodo属、Pavlova属、Cafeteria属、Paraphysomonas属、Chlamydomonas属、Pycnococcus属、Psammodictyon属、Caecitellus属，55号藻株属于Bacillariaceae科，54号藻株属于Chlorellales目，109号藻株属于Chromulinales目。这一结果验证了分子鉴定在微藻分类鉴定中的高效性。 3.对11株已鉴定的藻株进行生理生化分析，通过光密度法测定藻细胞浓度，观察藻细胞生长曲线，54号和109号藻株从进入指数生长期到指数生长期结束生长明显比其他藻株迅速;54、55、109、1号藻株比生长速率相对较高，其中54号藻株比生长速率最高，达到0.4415/d;利用冷冻干燥后称重的方法测定终生物量，59、72号藻株终生物量明显高于其他藻株，59号藻株终生物量最大，达到167.33g/mL;通过重量法测定总脂含量，54、109、59号藻株总脂含量相对较高，其中54号藻株总脂含量最高，达到藻细胞干重的40.42%;54、59、109号油脂产率明显高于其他藻株，59号藻株油脂产率最大，达到46.46g/mL。综合考虑各方面因素，54号、59号、109号藻株生长较迅速、油脂含量较高，比较适合用作微藻生物柴油原材料。

关键词：微藻分类鉴定 18S rDNA 筛选

三角褐指藻AA和EPA合成的Δ5脂肪酸去饱和酶研究

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三角褐指藻AA和EPA合成的Δ5脂肪酸去饱和酶研究

作者：刘冬梅中国海洋大学

学位级别：硕士

多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）指含有两个或两个以上双键且碳链长为16-22个碳原子的直链脂肪酸,如EPA（eicosapentaenoic acid, 20:5）和DHA（docosapentaenoic acid, 22:6）,他们对人类健康非常重要,比如:减轻炎症,调节血压,降低胆固醇的含量,调控脂类代谢,预防和治疗动脉粥样硬化和心血管疾病,调节机体的免疫功能,调节中枢神经系统功能,还可以开发为抗肿瘤药物。目前,EPA和DHA主要来源于深海鱼油,但是随着市场需求的迅速增长和海洋可捕捞鱼类资源的日益减少,深海鱼油已经远远不能满足需要,因此,寻找更为持续、稳定的LCPUFAs来源成为当务之急。海洋微藻是EPA和DHA的初级生产者,从微藻中提取PUFA的生产工艺比鱼油简单,而且产品没有鱼腥味,胆固醇含量低。但是海洋微藻多为自养藻,生长缓慢,细胞得率低,培养过程中容易染菌,所以,大规模从微藻中提取生产EPA和DHA来满足社会需求还不能实现。 PUFAs生物合成始于LA和ALA,该生物合成过程中涉及到一系列脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase, FAD）和脂肪酸延伸酶（fatty acid elongase, FAE）。FAD脱氢反应的机制是将脂肪酸链中C-C转化为C=C,每个FAD都在酰基链的特定位置引入双键。近年来,对海洋微藻PUFAs合成相关酶基因的研究进展非常快,已经从多个藻种中克隆了参与EPA和DHA合成所涉及的去饱和酶基因和延伸酶基因,并且实现了基因的异体表达,这为实现得到高产的PUFAs,解决EPA/DHA资源问题,降低生产成本,提供了一条新的途径。D5的功能验证具有重要的生化应用意义,该基因能够被用在富含PUFA的转基因油料作物上,具有重要的医疗和保健作用。加深对PUFA合成过程中基因调解机制的了解将会影响单细胞油脂的产量,比如,改善微藻的生长条件,可以将强EPA/DHA的产量,进而可以影响依靠微藻的养鱼业的发展。此外,FAD和FAE在食品工程,植物基因工程以及发酵工程等领域的广阔应用前景是毋庸置疑的,另外,二者在上述领域的应用将加深促进人们对脂肪酸合成途径的认识和研究。本论文实验材料三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）为自养藻,EPA含量丰富,可达总脂肪酸的30%以上,还含有少量的DHA,是研究脂肪酸合成途径中相关去饱和酶的非常好的实验材料。本文的工作内容和研究成果如下: 1.以三角褐指藻为研究材料,实验室培养,通过对其培养基中氮营养盐限制胁迫不同时间（12h、24h、48h、72h、96h）,研究了不同时间的氮营养盐胁迫对三角褐指藻生长生理及其脂肪酸组成的影响。试验结果表明,在试验设置的氮营养胁迫时间范围内,与对照相比,三角褐指藻的生长没有明显的变化;随着氮胁迫时间的延长,叶绿素a,类胡萝卜素以及叶绿素的含量明显下降;EPA的含量占总脂肪酸质量分数比也随氮胁迫时间的延长而减小。 2.Δ5脂肪酸去饱和酶（Δ5 fatty acid desaturase）是合成花生四烯酸（AA）和EPA的关键酶。为了构建三角褐指藻Δ5脂肪酸去饱和酶基因（简称D5）的原核表达重组质粒,并实现在*** BL21（DE3）中的表达。本研究根据GenBank中三角褐指藻D5序列,设计引物,扩增该基因并插入到pET28a中,测序鉴定后,转化*** BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明pET28a-D5构建成功,IPTG能诱导D5特异性表达。上述实验结果为真核生物膜蛋白的研究奠定基础。 3.本实验将三角褐指藻D5分离并将其转入酵母中进行表达,结果显示,重组蛋白能够将DGLA和20:4Δ8, 11, 14, 17转化成AA和EPA,转化效率分别为24.7%和59.4%。该结果表明,Δ5脂肪酸去饱和酶在ω-6和ω-3脂肪酸合成途径中都具有活性,能同时发挥去饱和作用。所以,对该脂肪酸合成以及调节机制的了解,为将来研究去饱和酶基因在油料作物中的转基因提供了前提条件。总之,对D5在分子水平上的探讨为今后开展包括EPA合成在内的多项研究奠定了基础,为人类健康和营养提供了保证。

关键词：多饱和脂肪酸 Δ5脂肪酸去饱和酶二十碳五烯酸二十碳四烯酸三角褐指藻

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富油微藻的采集与油脂合成关键酶的研究

富油微藻的采集与油脂合成关键酶的研究

作者：韩吉昌中国海洋大学

学位级别：硕士

全球工业化使得化石能源的消耗加速，而人类对能源的需求量却在急剧增加;同时化石燃料的燃烧引起了环境恶化和气候异常，因此人们开始关注环境友好型、可再生能源的开发和利用。基于以上原因，各国科学家对大豆、玉米、棕榈等高等植物... 详细信息

全球工业化使得化石能源的消耗加速，而人类对能源的需求量却在急剧增加;同时化石燃料的燃烧引起了环境恶化和气候异常，因此人们开始关注环境友好型、可再生能源的开发和利用。基于以上原因，各国科学家对大豆、玉米、棕榈等高等植物进行了诸多研究，试图找到合适的原料生产出数量和质量都可满足人类需求的生物燃料。虽然取得了许多成果，也解决了部分能源需求问题，但仍然面临着原材料不足、与人争粮等一系列问题，很难取得更大程度的进展。在此背景下，微藻由于具有油脂含量高、生长周期短、易于大规模培养、光合作用效率高等一系列优点而受到了研究者们的青睐。利用微藻生产生物柴油，尽管具有诸多优点，但是若要大规模生产出高质量的生物柴油，还有几个问题亟待解决。例如：微藻虽富含油脂，但最适合生产生物柴油的12:0和14:0在大多数种类微藻的油脂中所占比例不高。另外研究表明很多微藻在特殊环境下，总脂占细胞干重的比例会有所提高，但生物量也会大幅度下降，从而导致总脂的最终产量并不高。针对以上的几个问题，至少应从两个方面找寻解决途径。第一，从野外海域分离油脂含量高、生物量大、生长速度快、环境耐受性高的新型优良藻株代替或丰富现有的实验藻株。第二，通过基因工程的手段构建优质藻种，以解决现有藻种油脂含量高和生物量大不能共存的矛盾。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）为硅藻纲（Bacillariophyceae）舟形藻目（Naviculales）的真核微藻。因其具有油脂含量高、生长速度快、富含EPA（eicosapentaenoic acid,20:5n3）等优点而一直受到研究者们的关注;除此之外，其全基因组测序工作业已完成，多种转基因体系也已建立;都使得三角褐指藻成为微藻生物柴油领域中的热门藻株。研究证明三角褐指藻在限氮条件下，其油脂含量会大幅度的增加，但关于其油脂含量提高的机制尚无报道。基于以上情况，本实验首先从黄渤海海域分离、纯化可培养微藻70余株，通过18S rRNA和rbcL基因序列构建了NJ系统进化树，对这些藻株进行了种类鉴定;丰富了实验材料，为寻找优质的产油藻株奠定了基础。考虑到通过基因工程的手段构建富油藻株时，在目的基因的选择上具有很大的盲目性（而这也是导致实验结果不理想的重要原因），因此，本实验以三角褐指藻为研究对象，通过荧光实时定量PCR的方法监测了11个与油脂合成有关的酶基因在限氮168小时内转录水平的变化情况;用尼罗红染色法对三角褐指藻在同时间点上的油脂含量进行了测定;分析两者的相关性后，找到了多个与三角褐指藻油脂含量变化正相关的基因，为过量表达等技术在三角褐指藻甚至是硅藻中的应用提供了有价值信息;同时，本实验也对三角褐指藻的油脂合成路径进行了推测。

关键词：微藻生物柴油三角褐指藻分离鉴定

3种赤潮藻营养生理研究及典型微藻型赤潮自动监测预警软件研制与应用

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3种赤潮藻营养生理研究及典型微藻型赤潮自动监测预警软件研制与...

作者：姜广信中国海洋大学

学位级别：硕士

本文以赤潮异湾藻、塔马亚历山大藻和中肋骨条藻等3种赤潮藻为研究对象。在恒定的温度(22±1℃)和光照(光照强度3000±110lx,光照周期L:D为14:10)条件下,研究了5种营养因子(N、P、Si、Fe、Mn)及其不同浓度梯度(0、f/2、f、2f)对3种赤潮... 详细信息

本文以赤潮异湾藻、塔马亚历山大藻和中肋骨条藻等3种赤潮藻为研究对象。在恒定的温度(22±1℃)和光照(光照强度3000±110lx,光照周期L:D为14:10)条件下,研究了5种营养因子(N、P、Si、Fe、Mn)及其不同浓度梯度(0、f/2、f、2f)对3种赤潮藻生长繁殖的影响,探讨其营养生理。设计实验为5因子4水平正交试验,共计16个处理,重复数为3。试验过程中,营养盐浓度分5次取样,测定不同时期藻类培养液中的营养盐浓度;藻类生长情况每天取样一次,在显微镜下用血球计数板计数。研究结果表明:1、赤潮异湾藻在处理16条件下生长最佳,最高浓度达到89.29万个/ml,生长周期为20天;2、塔马亚历山大藻在处理11条件下生长最佳,最高浓度达到175万个/ml,生长周期为21天;3、中肋骨条藻在处理8条件下生长最佳,最高浓度达到58.54万个/ml,生长周期为11天。4、在添加营养盐的情况下,3种藻均比不添加营养盐时生长速度快,静止期细胞浓度也显著高于不添加营养盐时。这说明海水富营养化是这3种赤潮藻爆发赤潮的重要原因。5、在不添加其他营养盐的前提下,不同硝酸氮浓度对3种赤潮藻的生长速率几乎没有影响;在添加营养盐的情况下,与其他几种营养因子相比,不同硝酸氮浓度对3种赤潮藻静止期生物量有很大的影响,在较高硝酸氮浓度下,3种赤潮藻在静止期的最高浓度明显高于低硝酸氮浓度时的浓度。这说明,在富营养化条件下,硝酸氮更易诱发赤潮。6、磷酸盐是3种赤潮藻发生赤潮的限制性因素,与3种赤潮藻的生长繁殖有直

关键词：赤潮异湾藻塔马亚历山大藻中肋骨条藻营养生理自动监测预警软件

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大黄鱼精子和胚胎的超低温保存研究

大黄鱼精子和胚胎的超低温保存研究

作者：陈雄芳中国海洋大学

学位级别：硕士

近五十年来，超低温保存种质细胞技术已经趋于成熟，特别是近几年对海洋动物种质细胞的研究力度也开始逐渐加大。本研究结合国家高技术研究发展计划(863计划)中“重要海水养殖鱼类配子和胚胎的低温保存技术及其种子库的建立”课题研究... 详细信息

近五十年来，超低温保存种质细胞技术已经趋于成熟，特别是近几年对海洋动物种质细胞的研究力度也开始逐渐加大。本研究结合国家高技术研究发展计划(863计划)中“重要海水养殖鱼类配子和胚胎的低温保存技术及其种子库的建立”课题研究项目，进行了大黄鱼精子和胚胎超低温保存实验，得到了他们在液氮(-196℃)条件下的适宜保存条件。在大黄鱼精子超低温保存实验中，逐个筛选了方案中各个因素的最佳水平。实验筛选了二甲基亚砜(DMSO)、乙二醇(EG)、甘油(GLY)、丙二醇(PG)和甲醇(METH)五种抗冻剂配合X1—X5五种稀释液和三种添加剂的冷冻效果，发现X5+Gly10％+海藻糖0.015g／ml的抗冻溶液效果最好，可获得冻精复活率，授精率和孵化率分别为92％，48.8％和51％。本实验就降温过程筛选了程序降温法，分步投氮法和其二者相结合的方法，就复温过程筛选了28℃、43℃和70℃水浴解冻的各种方法。其中在液氮罐内-15℃位置停留10min后再在液氮面停留5min，然后投氮的两步投氮快速冷冻法加上43℃水浴解冻至完全融解效果最好，能达到85.3％的冻精复活率。而且这是操作最简单、历时最短的冷冻方法，适合生产现场应用。当稀释比为1：3时，不同样品体积对精子冷冻效果区别不大;当冻积为0.5ml时，精子稀释比1：3时冷冻效果最好。实验还用到精子动(静)态图像分析系统分析冻精活力情况，测出最佳冷冻方案冻精活动率为93.75％，其中快速向前运动的占50.0％。在大黄鱼胚胎超低温保存实验中，逐个筛选了方案中各个因素的最佳水平。实验筛选了DMSO、GLY、PG和METH四种抗冻剂配合稀释液和添加剂的冷冻效果，抗冻剂METH对胚胎的毒性最小而GLY毒性最大，胚胎在20%METH中平衡40分钟仍可保持81.8%的复活率，而在20%GLY中6分钟复活率就低于80%。且METH能使胚胎经超低温保存后保持形态最完整，能达到60%的形态完整率，而使心跳期胚胎经超低温保存后形态受损最严重的是PG，胚体大多数发白且成粉碎状。大黄鱼胚胎的超低温保存的最适抗冻液为X3+20%METH，0.159/ml乙酞胺能部分降低METH毒性，而METH10%+GLY10%能提高冷冻效果。一30℃为大黄鱼心跳期胚胎超低温保存的危险下限温度，从一30℃降到一40℃胚胎复活率从40一80%降为趋向于。。大黄鱼胚胎的超低温保存的最适降温方法为:一5℃·min一‘O℃---------一--一今一30℃(lmin)一30oC·min一‘一一一一一一一一一一一一一一令一180℃今NZ 最适复温方法为一80℃(Zmin)一舰3℃水浴解冻至融解1/2，再移到室温解冻到完全融解，最适洗脱方法为在0.5M蔗糖溶液中洗脱10分钟后移入海水孵化。在一26℃对样品植冰可提高胚胎超低温冷冻后的形态完整率46.8%。三者配合虽然没有得到复活胚胎，但能得到84.8%胚体、卵膜、卵黄囊和油球等形态都基本正常的胚胎。

关键词：大黄鱼精子胚胎超低温保存